骨髓间充质干细胞对严重烧伤大鼠肝脏损伤的修复作用研究

发布时间：2018-03-11 05:16

本文选题：骨髓间充质干细胞　切入点：烧伤　出处：《吉林大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在我国，烧伤年发病率约达人群的2％左右，严重烧伤甚至可危及生命，一直为社会和医学界所重视。严重烧伤发生后，机体的肠道屏障遭到严重破坏，肠道细菌移位，，导致内毒素血症的发生，如果治疗不及时，进一步可引发全身多器官功能的损伤。随着对烧伤认识水平的提高，因休克死亡的患者明显减少，多器官功能衰竭已成为当前临床上烧伤患者死亡的主要原因。目前临床处理多以补充血容量和抗感染为主，但是效果并不理想。如何减轻严重烧伤后引起的脏器损伤及促进损伤后再修复已经成为一个十分重要的课题。其中肝脏是人体最重要的代谢器官，能够保护其他脏器免受损伤，因此修复严重烧伤后肝损伤，对多器官功能衰竭的防治尤其重要。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）是一类具有强大增殖能力的多能干细胞，其具有多向分化潜能、来源方便、易于分离培养、免疫原性弱、进入体内后可定植于受损部位并修复其损伤等特性，因此，在修复病变组织损伤方面具有十分广阔的前景。已有研究表明：BMSCs局部应用能够修复局部烧伤创面，静脉移植可修复各种肝脏疾病，但关于BMSCs静脉移植能否治疗严重烧伤引起的肝损伤还未见报道。因此本课题将BMSCs移植到严重烧伤的大鼠体内，探讨其对严重烧伤引起的肝损伤的修复作用及其作用机制，希望为临床治疗严重烧伤提供新的思路。本研究采用贴壁培养法分离、纯化BMSCs，扩增后应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表面标志，并诱导其向成骨细胞分化。选用成年雄性Wistar大鼠，分为正常对照组、模型组（经球后静脉注入生理盐水0.1mL）和细胞治疗组（经球后静脉注入BMSCs0.1mL，1×107个），每组10只。制备大鼠烧伤模型，将氯甲基苯甲酰胺（CM-Dil）标记的BMSCs经球后静脉移植到细胞治疗组的大鼠体内，模型组大鼠注射等体积生理盐水。每日观察各组大鼠一般状态，分别在细胞移植后1和2周称量大鼠体重，计算创面愈合率。细胞移植后2周取血及大鼠肝组织，通过检测血清中ALT、AST和LDH的含量，HE染色进行病理组织学观察并评分，免疫组织化学法检测PCNA的表达，TUNEL法检测肝细胞凋亡，Western blot法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3和P-ASK1的表达，观察各组大鼠肝功能、肝组织病理、肝细胞增殖、肝细胞凋亡情况及凋亡相关蛋白的表达。细胞移植后2周利用激光共聚焦显微镜观察BMSCs在细胞治疗组大鼠肝组织内的定植情况。本研究结果显示：贴壁培养法得到的BMSCs生长状态良好。流式细胞术检测得到的BMSCs CD44和CD90呈阳性，基本不表达CD45，大部分细胞处于相对不活跃的静止期。BMSCs被诱导分化为成骨细胞，茜素红染色呈阳性。细胞移植后2周，模型组大鼠明显萎靡少动；细胞治疗组大鼠行为状态明显较好，细胞治疗组大鼠体重及创面愈合率显著大于模型组（P0.05）。ALT、AST和LDH结果表明细胞治疗组大鼠肝功能显著优于模型组（P0.05）。HE染色及病理评分表明细胞治疗组大鼠肝组织病理形态改变显著优于模型组。免疫组化结果显示，与模型组比较，细胞治疗组PCNA表达显著增加（P0.05）。TUNEL结果表明细胞治疗组肝细胞凋亡率显著低于模型组（P0.05）。Western blot结果显示，与正常对照组比较，模型组Bax、Caspase-3和P-ASK1蛋白表达显著增加（P0.05），而Bcl-2表达显著减少（P0.05），Bcl-2与Bax比值（Bcl-2/Bax）显著降低（P0.05）；与模型组比较，细胞治疗组Bax、Caspase-3和P-ASK1蛋白表达显著减少（P0.05），而Bcl-2表达显著增加（P0.05），Bcl-2/Bax显著增高（P0.05）。激光共聚焦显微镜观察结果显示，在细胞治疗组大鼠肝组织中存在CM-Dil标记的BMSCs。结论： BMSCs静脉移植后能够向受损肝组织定植，对严重烧伤引起的肝损伤有明显的修复作用，其修复机制可能与促进肝细胞增殖和抑制细胞凋亡有关。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R644

【参考文献】