尼古丁通过α7nACHR调节人脐带间充质干细胞功能的研究

发布时间：2018-03-11 20:04

本文选题：间充质干细胞　切入点：烟碱样乙酰胆碱受体　出处：《第二军医大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：多器官功能障碍综合征（Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)是外科重症监护病房内患者最常见的死亡原因，MODS的严重程度与患者的住院日和死亡率显著相关⑴组织细胞的凋亡与坏死以及全身炎症反应综合症（sysetmaticinlfammatory response syndrome，SIRS)是MODS的发病基础，是MODS治疗中最棘手的问题至今尚无有效的治疗方法。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)来源于中胚层，具有自我更新和增殖能力，在恰当的微环境里具有向血管、脂肪、神经、软骨、骨等多个胚层组织细胞分化的潜能[2]。并且间充质干细胞具有免疫调制功能，可以抑制促炎因子的产生，促进抗炎因子的释放[3]。间充质干细胞具有易获得、低免疫原性、能在宿主体内长期存活并在适宜的微环境诱导下归巢到损伤部位且分化为特异的组织细胞，参与自身修复及免疫调节功能等特点w。烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChR)a-7亚型是迷走神经激活的“胆碱能抗炎通路”的一个重要成分，激活a7nAChR可以明显抑制TNF-a、IL-1、IL-6、高迁移率族蛋白B1(HGMB1)等致炎因子的产生，促进TGF-后、IL-10等抗炎因子的产生。两种机制同时激活起到协同抗炎的作用。a7nAChR的特异性激动剂尼古丁（Nicotine)比乙酰胆碱更有效地抑制促炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、HGMB1的释放和抗炎因子TGF-后、IL-10的产生[5’6]。目前尚无研宄报道证实间充质干细表面是否表达a7nACHR，也没有相关研宄报道证实尼古丁可通过a7nACHR调节间充质干细胞的功能。本研宄首次证实了间充质干细表面表达a7nACHR。尼古丁是a7nACHR的特异性激动剂，并且首次证实了经小剂量尼古丁预处理的MSCs的免疫调节抗炎功、增殖能力、迁徙能力及粘附能力增强。为MSCs应用于MODS的治疗提供了新的理论依据。本研宄分为二部分，第一：从人脐带分离间充质干细胞，并进行鉴定及检测其增殖及诱导分化能力；第二：通过Western blot技术证明间充质干细胞表面表达a7nACHR0尼古丁是a7nACHR的特异性激动剂，经小剂量尼古丁预处理的人脐带间充质干细胞与植物血凝集素刺激的人外周血单核细胞共培养，抑制植物血凝集素刺激的外周血单核细胞释放促炎症因子TNF-a，并促进植物血凝集素刺激的外周血单核细胞释放抗炎因子IL-10。经小剂量尼古丁预处理的间充质干细胞的增殖能力、迁徙能力及粘附能力增强。但是随着尼古丁剂量的增加，MSCs的能力呈现衰减趋势，提示大剂量尼古丁可能对MSCs产生了毒性作用。第一部分脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的：从人脐带中分离并体外培养扩增间充质干细胞，鉴定并检测其增殖及诱导分化能力。方法：采用组织微块贴壁培养法分离培养人脐带间充质干细胞，在固定时间内进行消化、传代和扩增。通过倒置显微镜观察细胞形态学特征、透射电镜观察细胞的超微结构、流式细胞仪技术、成骨细胞诱导、成脂肪细胞诱导等方法鉴定其为正在分化的间充质干细胞。结果：采用人脐带微组织块贴壁培养法分离，培养的细胞表现为成纤维细胞样外观的长梭形，单核，有较长的突起，贴壁生长，融合度较高的细胞呈漩涡状生长。流式细胞仪鉴定细胞表面CD29、CD44、CD90、CD105高表达，不表达CD34、CD45、HLA-DR。间充质干细胞可以分化为成骨细胞及成脂肪细胞。结论：以人脐带来源可以分离培养出间充质干细胞，，且细胞数量稳定，具有典型间充质干细胞形态特点，具有分化为成骨细胞及成脂肪细胞的潜能。为下一步的研宄提供技术支持。第二部分：尼古丁通过a7nACHR调节人脐带间充质干细胞功能的研究目的：证明人脐带间充质干细胞表面表达a7nACHR。尼古丁是a7nACHR的特异性激动剂，分析经尼古丁预处理后人脐带间充质干细胞免疫调节功能、增殖能力、迁徙能力及粘附功能力的变化，为进一步探讨间充质干细胞在临床相关疾病中的应用奠定基础。方法：应用western blot技术鉴定间充质干细胞表面表达a7nACHR。取生长状态良好的P3代间充质干细胞，随机分为6组，标记为A、B、C、D、E、F,依次加入（0、10umol/L、15umol/L20umol/L50umol/L)6种浓度的尼古丁预处理2h，然后分别消化间充质干细胞，按照每孔lx W5个细胞接种于24孔培养板中。经供者授权同意后，无菌条件下采集健康供者外周静脉血10ml。分离人外周血单个核细胞，待间充质干细胞贴壁后，每孔加入2xl06个人外周血单个核细胞及2ul植物血凝集素(10mg/L),共培养72h后，离心采集上清。用ELISA检测培养上清中TNF-a和IL-10的表达水平。取生长状态良好的P3代间充质干细胞，随机分为6组，标记为A、B、C、D、E、F，依次加入（0、10umol/L、15umol/L20umol/L50umol/L)6种浓度的尼古丁预处理2h后，消化接种于24孔板检测其增殖能力。取生长状态良好的P3代间充质干细胞，随机分为6组，标记为A、B、C、D、E、F，依次加入（0、10umol/L、15umol/L、20umol/L、50umol/L)6种浓度的尼古丁预处理2h后，检测其迁徙能力及粘附功能。结果：Westenr blot结果提示间充质干细胞表面表达a7nACHR。ELISA法检测结果提示经小剂量尼古丁预处理的人脐带间充质干细胞与植物血凝集素刺激的人外周血单核细胞共培养，抑制植物血凝集素刺激的外周血单核细胞释放促炎症因子TNF-a,并促进植物血凝集素刺激的外周血单核细胞释放抗炎因子IL-10。经小剂量尼古丁预处理的间充质干细胞的增殖能力、迁徙能力及粘附能力增强。但是随着尼古丁剂量的增加，MSCs的能力呈现衰减趋势，提示大剂量尼古丁可能对MSCs产生了毒性作用。结论：间充质干细胞表面表达a7nACHR，经小剂量a7nACHR的特异性激动剂尼古丁预处理后的间充质干细胞免疫调节功能、增殖能力、迁徙能力及粘附功能增强。小结：组织细胞的凋亡与坏死以及全身炎症反应综合症是MODS的发病基础。间充质干细胞能在体内长期存活并在局部微环境诱导下归巢到损伤部位，间充质干细胞的免疫调节功能可以抑制植物血凝集素刺激的外周血单核细胞促炎因子的释放，促进抗炎因子的产生，进而参与SIRS及MODS的炎症调节。间充质干细胞应用于MODS的预防和治疗具有良好的前景，间充质干细胞表面表达a7nACHR。尼古丁是a7nACHR的特异性激动剂，小剂量尼古丁可以增强间充质干细胞的免疫调节功能，增殖能力、迁徙能力及粘附功能力，进而可以提高间充质干细胞治疗MODS的有效性。但是随着尼古丁剂量的增加，MSCs的能力呈现衰减趋势，提示大剂量尼古丁可能对MSCs产生了毒性作用。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R459.7

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