miR-155上调自噬对脓毒症大鼠肺保护作用的实验研究

发布时间：2018-03-14 02:00

本文选题：肺泡巨噬细胞　切入点：微小RNA-155(miR-155)　出处：《南昌大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应,临床表现从发热、心率快到出现呼吸困难、血压下降、意识模糊、尿少等器官功能障碍。脓毒症是导致ICU重症患者死亡的首位原因,即使经过及时抗感染、支持治疗,其死亡率仍高达20%~60%。脓毒症患者最终死亡的主要原因为脓毒症引起的MODS,其中最常见的是ARDS。ARDS是一种危及生命的的临床综合征,死亡率30%~60%。临床表现为顽固性低氧血症,非心源性的呼吸衰竭;胸片表现为双肺浸润性肺水肿。ARDS的发病机制研究指出,肺泡巨噬细胞过度激活,炎症介质失控性释放是导致脓毒症肺损伤的主要原因。在失控性释放的炎症介质中,TNF-α、IL-1β被认为是最具生物活性的早期炎症因子,可启动肺内炎症“瀑布”反应,造成急性肺损伤。自噬作为机体内一种基本代谢机制,在营养代谢、肿瘤发生及炎症免疫等方面有重要作用。目前研究已获悉,自噬可清除细胞内受损线粒体,阻止活性氧与线粒体DNA进入胞浆,使Caspase-1活化受阻,使得IL-1β前体不能剪切为成熟的IL-1β。此外,微小RNA在生物体内也发挥强大的生物调节功能。引起感染的病原微生物组分以及早期炎症因子,如LPS、TNF-α、IL-1β等,可刺激单核巨噬细胞使得miR-155上调;反过来,miR-155又与TLR炎症通路中调节蛋白的mRNA结合,阻止其翻译,抑制炎症反应的扩散。尽管自噬和miR-155都能够通过各自机制来调控炎症反应;但是,在炎症反应中自噬与miR-155是否有关联尚不清楚。因此,弄清炎症反应与自噬、miR-155三者之间关系,发现它们相互作用的机制,将有助于脓毒症肺损伤的预防治疗和研发治疗此病的新型药物。第一部分LPS刺激NR8383细胞后炎症反应与自噬、mi R-155变化目的:观察LPS刺激NR8383细胞后炎症因子、自噬蛋白及miR-155表达的动态变化,探讨脓毒症时炎症反应与自噬及miR-155三者之间关系。方法:常规培养NR8383细胞,LPS刺激0.5、3、6、12、24小时后收集细胞和细胞上清液;采用ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-1;采用Western Blot检测细胞中的lc3Ⅱ/Ⅰ、tab2、caspase-1;采用rt-qpcr检测细胞中mir-155。结果:正常组tnf-α、il-1分别为20.12±7.20与894.34±77.98pg/ml,pbs组tnf-α、il-1分别为19.63±6.51与1024.50±113.47pg/ml,两组比较无明显差异(p0.05)。lps刺激0.5小时tnf-α、il-1为230.37±19.28与3281.50±263.29pg/ml,lps刺激3小时为360.35±33.28与3908.50±228.47pg/ml,lps刺激6小时为560.35±43.62与4601.84±301.27pg/ml,lps刺激12小时为860.46±84.62与6201.83±173.93pg/ml,lps刺激24小时为601.21±54.73与4008.62±247.45pg/ml。与正常组比较,lps刺激0.5、3、6、12、24小时的tnf-α、il-1均有明显差异(p0.05);而且lps刺激12、24小时两组比较有明显差异(p0.05)。正常组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.11±0.04,pbs组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.09±0.06,两组比较无明显差异(p0.05)。lps刺激0.5小时lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.46±0.07,3小时为0.51±0.13,6小时为0.59±0.09,12小时为0.81±0.13,24小时为0.56±0.07。与正常组比较,lps刺激0.5、3、6、12、24小时lc3Ⅱ/Ⅰ比值均有明显差异(p0.05);而且lps刺激12、24小时两组比较有明显差异(p0.05)。与正常组比较,pbs组tab2表达为0.83±0.11倍,lps刺激0.5小时tab2表达为1.2±0.17倍,3小时为0.93±0.12倍,6小时为1.2±0.04倍,12小时为1.04±0.17倍,24小时为1.27±0.09倍。各组间均无明显差异(p0.05)。与正常组比较,pbs组caspase-1表达为1.1±0.20倍(p0.05),lps刺激0.5小时caspase-1表达为4.82±0.32倍(p0.05),3小时为8.23±0.41倍(p0.05),6小时为11.29±0.54倍(p0.05),12小时为12.63±0.39倍(p0.05),24小时为9.87±0.49(p0.05)。而且lps刺激12、24小时两组比较有明显差异(p0.05)。与正常组比较,pbs组mir-155表达为0.91±0.33倍(p0.05),lps刺激0.5小时mir-155表达为1.21±0.19倍(p0.05),lps刺激3小时为1.41±0.20倍(p0.05),lps刺激6小时为1.74±0.18倍(p0.05),lps刺激12小时为3.11±0.12倍(p0.05),lps刺激24小时为7.82±0.30倍(p0.05)。结论:lps刺激nr8383细胞后,炎症反应增强,12小时达到峰值。mir-155的表达逐渐增强,自噬也逐渐增强,且都呈现时间依赖模式。此外,caspase-1表达增加的趋势与炎症反应增强的趋势一致。第二部分mir-155影响自噬及自噬调控炎症反应的分子机制目的:探讨mir-155影响自噬以及自噬调控炎症反应的机制。方法:上调mir-155后,以lps刺激nr8383细胞,12小时后收集细胞和细胞上清液。采用elisa检测细胞上清液中tnf-α、il-1,采用westernblot检测细胞中的lc3Ⅱ/Ⅰ、tab2及caspase-1。随后抑制mir-155,仍以lps刺激nr8383细胞,12小时后收集细胞和细胞上清液进行上述的检测。结果:1.与正常细胞比较,mir-155mimics转染nr8383细胞24小时后mir-155表达为236.73±46.49倍(p0.01)。正常组tnf-α、il-1分别为18.83±5.65与583.83±47.29pg/ml,lps组tnf-α、il-1分别为774.84±59.23与5806.28±167.01pg/ml,lps+mimics组tnf-α、il-1分别为347.84±27.16与2087.27±83.20pg/ml。组间比较均有明显差异(p0.05)。正常组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.13±0.04,lps组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.49±0.11,lps+mimics组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.79±0.14。组间比较均有明显差异(p0.05)。与正常组比较,lps组tab2表达为0.92±0.08倍(p0.05),lps+mimics组tab2表达为0.32±0.04倍(p0.05);lps+mimics组与lps组比较有明显差异(p0.05)。与正常组比较,lps组caspase-1表达为11.57±0.23倍,lps+mimics组caspase-1表达为7.27±0.16倍。组间比较均有明显差异(p0.05)。2.与正常细胞比较,mir-155inhibitor转染nr8383细胞24小时后mir-155表达为1.6±0.34倍(p0.05)。正常组tnf-α、il-1分别为17.45±3.90与558.40±45.31pg/ml,lps组tnf-α、il-1分别为581.27±60.14与5506.37±114.47pg/ml,lps+inhibitor组tnf-α、il-1分别为811.38±45.68与7036.08±120.63pg/ml。组间比较均有明显差异(p0.05)。正常组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.14±0.02,lps组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.65±0.11,lps+inhibitor组lc3Ⅱ/Ⅰ比值为0.43±0.06。组间比较均有明显差异(p0.05)。与正常组比较,lps组tab2表达为1.23±0.16倍(p0.05),lps+inhibitor组tab2表达为2.11±0.30倍(p0.05)。lps+inhibitor组与lps组比较有明显差异(p0.05)。与正常组比较,lps组caspase-1表达为12.60±0.31倍,lps+inhibitor组caspase-1表达为15.16±0.29倍。组间比较均有明显差异(p0.05)。结论:上调mir-155后,自噬反应增强;抑制mir-155后,自噬反应减弱。mir-155通过其靶蛋白tab2,又称为自噬反应的分子开关,与自噬反应联动。自噬负性调控caspase-1,避免其剪切成熟的il-1,从而发挥调控炎症的功能。第三部分导入大鼠体内的mir-155对炎症反应、自噬的影响目的:用invivo-jetpeitm试剂将mir-155导入大鼠肺内,观察大鼠肺内炎症损伤及自噬小体形成,研究mir-155对脓毒症大鼠肺保护作用及机制。方法:选择9只雄性成年sd大鼠,分为正常组、lps组、lps+mir-155组,每组3只。lps组大鼠气管内滴入lps(7.5mg/kg),诱导大鼠ali模型,6小时成模后处死。lps+mir-155组大鼠气管内预先滴入invivo-jetpeitm试剂荷载的mir155mimics(40μg/只),24小时后再滴入lps(7.5mg/kg),6小时后处死。正常组大鼠也完成相应操作,气管内滴入生理盐水,6小时后处死。3组大鼠腹主动脉采血行血气分析;取左肺相同部位的肺组织测量湿/干重比,常规病理切片he染色,电镜观察自噬小体;右肺balf离心后,上清液和细胞分别用于检测炎症因子tnf-α、il-1和mir-155。结果:与正常组比较,lps组大鼠balf分离细胞的mir-155表达为5.87±0.34倍(p0.05),lps+mir-155组大鼠balf分离细胞的mir-155表达为95.23±16.84倍(p0.01)。正常组大鼠balf中tnf-α、il-1分别为48.51±8.21与678.64±55.32pg/ml;lps组tnf-α、il-1分别为745.99±34.45与5482.10±119.57pg/ml;lps+mir-155组分别为364.68±23.00与2349.38±55.09pg/ml。组间比较均有差异(p0.05)。正常组大鼠两肺无水肿,无出血;lps组大鼠两肺有多个出血点,有明显水肿;lps+mir-155组大鼠两肺外观介于二者之间。正常组大鼠肺w/d比值为4.17±0.22,lps组大鼠肺w/d比值为5.61±0.26,lps+mir-155组大鼠肺w/d比值为4.97±0.20;组间比较均有差异(p0.05)。正常组大鼠氧合指数为420.63±34.96mmhg,lps组大鼠氧合指数为271.42±23.46mmhg,lps+mir-155组氧合指数为315.76±16.08mmhg;组间比较均有差异(p0.05)。正常组大鼠肺组织病理切片显示细胞无肿胀,结构整齐;lps组大鼠肺组织病理切片显示细胞、细胞间隙肿胀,结构紊乱;lps+mir-155组大鼠肺组织病理切片表现介于二者之间。正常组大鼠巨噬细胞电镜显示未见自噬小体形成;LPS组大鼠巨噬细胞电镜显示见2个自噬小体形成;LPS+miR-155组大鼠巨噬细胞电镜显示见7个自噬小体形成。结论:经气管导入大鼠体内的miR-155通过上调自噬减轻LPS诱导的急性肺损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7

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