体外心脏震波治疗在大鼠急性心肌梗死心肌细胞凋亡中的作用和机制研究

发布时间：2018-03-22 05:09

本文选题：体外心脏震波治疗　切入点：急性心肌梗死　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：心肌缺血导致的细胞凋亡在冠心病心肌细胞数目减少和功能损伤中起重要作用。心脏震波治疗(Cardiac Shock Wave Therapy, CSWT)是国际上新近发展起来的严重冠心病治疗方法。国内外研究结果显示,CSWT可以通过促进缺血心肌血管新生、减轻炎症反应以及氧化应激等机制改善心肌血流灌注,减轻左室重构,改善左心功能。但CSWT对缺血后心肌细胞凋亡的作用和机制少有报道。我们前期的研究证实震波治疗可以减轻缺血缺氧诱导的H9c2细胞凋亡。在前期细胞学研究的基础上,我们采用大鼠急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)模型进一步探讨CSWT对AMI后心肌细胞凋亡的影响及可能的调控机制；我们还将通过组织、细胞及分子等水平评估CSWT的安全性,为CSWT治疗缺血性心脏病提供新思路及基础理论依据。方法：1选用2月龄的雄性Wistar大鼠,通过结扎冠状动脉左前降支建立AMI模型。2采用Western blot方法分别检测AMI 6h、12h、24h、36h、48h后梗死边缘区心肌细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3)的表达；以末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, TUNEL)检测心肌细胞凋亡率。3对AMI后12h的大鼠模型分别施加600次、800次、1000次的震波不同剂量，Western blot方法检测梗死边缘区心肌细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、 Cleaved-Caspase-3)的表达。4对AMI后12h大鼠模型进行震波治疗(能量：0.1mJ/mm2,次数：800次,频率：4Hz),AMI后36h处死大鼠,收集心脏标本。标本的石蜡切片进行H＆E染色；TUNEL法检测心肌细胞凋亡率；Western blot法检测梗死边缘区心肌细胞线粒体与胞浆中细胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)的含量、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、 Cleaved-Caspase-3)的表达以及JNK、p38MAPK、Akt信号通路蛋白的磷酸化水平。5对Wistar大鼠进行震波处理(能量：0.1mJ/mm2,次数：800次,频率：4Hz),处理前、后分别记录大鼠心电图,检测血压、心率,24h后处死大鼠,收集心脏标本。标本的石蜡切片行苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin, H E)染色,观察心肌组织病理学改变；TUNEL法检测心肌细胞凋亡率；Western blot法检测心肌细胞线粒体与胞浆中Cyt C的含量、凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3)的表达以及JNK、p38MAPK、Akt信号通路蛋白的磷酸化水平。结果：1、 AMI大鼠模型体外心脏震波治疗方法的建立1.1成功建立大鼠AMI模型,存活率为75.4%,死亡率为24.6%,存活模型的成功率为93.9%。1.2探讨震波治疗时机分别于AMI 6h、12h、24h、36h、48h观察梗死边缘区心肌细胞的凋亡,TUNEL检测结果显示正常对照组(NC组)、AMI 6h、12h、24h、36h、48h的心肌细胞凋亡率分别为4.31%、8.16%、19.96%、30.96%、48.59%、69.28%,其中AMI 12h心肌细胞的凋亡率较NC组显著升高(P0.01),但明显低于AMI 24h和36h(P0.01),提示AMI 12h细胞凋亡已明显增加但尚未发生大量凋亡,同时Bax蛋白的表达(2.69±0.44)较NC组(1.00±0.34)开始显著升高,提示凋亡上游信号通路启动明显增强,因此选取AMI 12h作为后续研究震波治疗的时间点。1.3探讨震波治疗次数分别尝试600次、800次、1000次的震波次数对AMI大鼠模型进行震波治疗,结果显示,与心肌梗死组比较,各震波次数组梗死边缘区心肌细胞Bcl-2蛋白均明显升高,Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白均明显降低。其中,应用800次震波时,Bcl-2蛋白的表达最高、Bax与Cleaved-Caspase-3蛋白的表达最低。因此后续研究选取800次进行震波治疗。2、CSWT对AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制探讨实验分为假手术组(sham组)、假手术+震波组(sham+SW组)、心肌梗死组(AMI组)、心肌梗死+震波组(AMI+SW组)2.1 H E染色结果显示,与sham组比较,AMI组梗死边缘区心肌细胞空泡样变性、坏死,炎性细胞浸润,AMI+SW组可见类似改变。2.2 TUNEL检测结果显示,sham组、AMI组、AMI+SW组梗死边缘区心肌细胞凋亡率分别为7.52±1.24%、48.92±5.13%、25.33±3.55%,AMI组较sham组明显升高(P0.01),震波治疗则可以明显降低心肌细胞的凋亡率(P0.01)。2.3 Western blot结果显示,sham组、AMI组、AMI+SW组梗死边缘区心肌细胞线粒体Cyt C含量分别为：1.00±0.19、0.42±0.06、0.93±0.20；胞浆Cyt C分别为：1.00±0.12、4.91±0.71、2.68±0.70。与sham组比较,AMI组心肌细胞线粒体Cyt C含量明显减少,胞浆Cyt C含量明显增高；震波治疗可以明显抑制AMI后心肌细胞cyt C从线粒体向胞浆的转移,结果均有统计学差异。提示CSWT可以保护AMI后心肌细胞线粒体膜通透性,抑制Cyt C的释放,具有线粒体保护作用。2.4 Western blot结果显示,sham组、AMI组、AMI+SW组梗死边缘区心肌细胞Bcl-2蛋白的表达分别为1.00±0.11、0.80±0.14、1.09±0.11；Bax蛋白的表达分别为：1.00±0.16、4.95±0.45、3.09±0.30；Cleaved-Caspase-3蛋白的表达分别为：1.00±0.11、4.36±0.71、1.72±0.33。与sham组比较,AMI组心肌细胞Bcl-2蛋白的表达明显下调,Bax以及Cleaved-Caspase-3蛋白的表达明显上调；震波治疗可以明显上调AMI后Bcl-2蛋白的表达,下调Bax, Cleaved-Caspase-3蛋白的表达,结果均有统计学差异。2.5 Western blot结果显示,sham组、AMI组、AMI+SW组JNK蛋白的磷酸化水平分别为：1.00±0.08、2.23±0.72、0.78±0.21；p38MAPK蛋白的磷酸化水平分别为：1.00±0.04、1.49±0.16、1.25±0.24；Akt蛋白的磷酸化水平分别为：1.00±0.09、0.41±0.09、0.38±0.09。与sham组比较,AMI后梗死边缘区心肌细胞JNK. p38MAPK蛋白的磷酸化水平明显升高,Akt蛋白的磷酸化水平明显降低；震波治疗后,与AMI组比较,JNK蛋白的磷酸化水平明显下降(P0.01),p38MAPK与Akt蛋白的磷酸化水平无明显变化。提示AMI后心肌细胞凋亡、炎症相关信号通路激活,震波治疗可能通过抑制JNK信号通路从而抑制AMI后心肌细胞的凋亡,达到心肌保护作用。3、CSWT的心脏安全性研究大鼠心肌的正常对照组(NC组)与正常对照+震波组(NC+SW组)结果显示：3.1 H E染色结果显示,震波治疗后心肌细胞无变性坏死,心肌间质无炎症细胞浸润。3.2 TUNEL检测结果显示,两组心肌细胞凋亡率无明显差异(P=0.71)。3.3两组心肌细胞线粒体Cyt C含量(P=0.10)及胞浆Cyt C含量(P=0.76)无明显变化。3.4两组Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase-3蛋白的表达均无统计学差异(P值分别为0.12、0.66、0.42)；JNK、p38MAPK及Akt信号通路蛋白磷酸化水平无统计学差异(P值分别为0.07、0.69、0.74)。3.5治疗前、后大鼠心电图未观察到异常改变。两组大鼠的血压、心率无统计学差异。结论：1 AMI后梗死边缘区心肌细胞线粒体Cyt C向胞浆释放增加,Bax与Cleaved-Caspase-3的表达上调,Bcl-2的表达下调,促进大鼠心肌细胞凋亡,导致AMI后心肌细胞的损失和功能降低。2 CSWT可以减少AMI后梗死边缘区心肌细胞线粒体Cyt C向胞浆释放,降低Bax与Cleaved-Caspase-3的表达,升高Bcl-2的表达,减轻AMI后心肌细胞的凋亡。3 CSWT可能通过抑制JNK信号通路,从而抑制凋亡信号的激活,达到心肌保护的作用。4治疗剂量的SW对大鼠是安全的方法。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22

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