脓毒症患者A20基因启动子区SNP分析及其与LPS反应性的关系

发布时间：2018-04-04 13:43

  本文选题：A20　切入点：NF-κB　出处：《第三军医大学》2013年硕士论文

【摘要】：炎症过度是临床炎症性疾病发生发展的基础，包括脓毒症、类风湿性关节炎、肿瘤、系统性红斑狼疮等，其共同的特点是体内组织细胞NF-κB活性异常升高[1-4]，从而引发全身或局部组织器官炎症反应过度，造成全身或局部组织器官损伤。脓毒症(sepsis)是由感染引起的SIRS，可进一步发展导致脓毒症休克及MODS[5]，甚至MOF，它是严重创伤后最常见的并发症，也是临床危重患者死亡的重要原因。血中细菌或病灶内细菌释放出的大量内毒素LPS是导致脓毒症的主要致病因子之一，LPS释放至血液，可引起炎症的激活及细胞因子的释放，导致致炎和抗炎失衡。有学者对创伤后脓毒症的基础进行了深入研究[6]，但至今仍然不能彻底解释脓毒症发生发展的机制。国内外研究普遍认为脓毒症发生、发展、转归有一定的遗传背景[7,8]。 锌指蛋白A20又名肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor α inducedprotein3, TNFAIP3),其基因编码一种双重泛素化编辑蛋白，能通过泛素化或去泛素化多种信号分子从而抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路的活性[9]。多种炎症刺激因素，如LPS，都能诱导体内多种细胞表达A20，而A20表达又对TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、细胞间粘附分子等多种促炎因子的过度释放以及细胞凋亡和坏死有明显的抑制作用。这种A20蛋白的“NF-κB反馈依赖性表达”是炎症内源性保护的重要机制。因此，本研究从炎症的内源性保护蛋白A20出发，研究人群间其基因表达上的差异，探寻脓毒症临床表型差异性的物质基础。 为此，本研究课题用生物信息学方法筛选出A20基因启动子区可能影响基因表达的重点区域及SNP位点，通过基因测序的方法分析中国四川地区汉族人群A20基因启动子区这些SNPs分布频率，并深入研究脓毒症患者与正常人群间SNPs的分布差异，然后通过LPS刺激不同基因型个体，分别以RT-PCR和流式细胞学的方法检测各组间外周血A20mRNA以及蛋白的表达差异、以EMSA的方法观察不同基因型对NF-κB活性的影响，以ELISA的方法比较各细胞因子的水平。主要结果及结论如下： 1.生物信息学分析显示，A20基因启动子区-2000bp内有15个SNP位点，其中有2个位点位于功能性重复序列、9个位点位于转录因子结合区域，这些位点的可能会影响此区域结合的转录因子发生种类、数量及活性的变化,藉此改变A20基因的转录活性，而其核心启动子区及NF-κB结合位点未发现已知SNP位点； 2.通过对135例四川地区汉族健康人群及223例严重创伤病人(其中103例并发脓毒症、120例未并发脓毒症)的SNP调查分析显示，中国人群A20基因启动子区高度保守，-1083C/T(rs5029924)和-558T/G(rs139054966)变异发生频率分别为12.2%、1.1%，未发现其它SNP位点。其中rs139054966为低频SNP，无分析意义，而rs5029924的基因型分布频率和等位基因频率在创伤后脓毒症患者与体检健康人群及创伤后非脓毒症患者之间均存在显著差异，而创伤后非脓毒症患者和健康对照间差异没有统计学意义，提示此SNP位点可能与创伤后脓毒症的发生相关； 3.以LPS刺激rs5029924位点不同基因型个体全血，刺激后，CC纯合子A20mRNA及蛋白表达水平均显著高于突变个体(CT/TT)，细胞因子TNF-α及IL-1β产生水平则显著低于突变个体，，而NF-κB的DNA结合活性在CC基因型最低，CT型次之，TT型最高。这表明rs5029924位点的变异可能通过降低A20的表达，进而改变NF-κB的活性，显著增强个体的内毒素反应性，进一步验证了第二部分“此SNP位点与脓毒症的发生相关”的推断，说明该SNP对于临床脓毒症易感性具有重要意义。
[Abstract]:Inflammation is an important factor in the development of inflammatory diseases , including sepsis , rheumatoid arthritis , tumor , systemic lupus erythematosus , etc .

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本文编号：1710202