TOB1缺失的MSCs在肩袖损伤腱骨愈合中的作用及机制研究

发布时间：2018-04-22 06:18

  本文选题：Tob1 + 腱骨愈合　； 参考：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：背景:肌腱-骨交界处损伤修复后形成的瘢痕组织界面,容易发生再次断裂,94%肩袖肌腱修复后没有恢复到腱骨愈合。移植的肌腱和骨之间的瘢痕组织是机械性能弱于本体组织,失败率高。因此,迫切需要新的修复策略来改善肩袖腱骨愈合。最近,以骨髓间充质干细胞MSCs为基础的生物治疗提供了一种潜在的方法来改善肩袖修复。Tob1是Tob/B细胞易位基因(BTG)家族的一个成员,Tob1能够通过负性调节BMP/Smad信号通路调控成骨细胞的增殖和分化。本研究中,我们探讨骨髓间充质干细胞Tob1缺失对大鼠肩袖损伤修复模型改善腱骨愈合的影响,Tob1的上游调控目前没有报道,mi R-218是MSCs中有力的成骨mi R,我们进一步研究其可否调节Tob1表达和对腱骨愈合的影响。目的:1.探讨大鼠骨髓间充质干细胞MSCs的Tob1基因缺失的生物学特性,为下一步研究腱骨愈合打下基础。2.探讨Tob1基因缺失的大鼠MSCs促进肩袖损伤腱骨愈合影响的研究。3.探讨调控Tob1表达的mi RNA的鉴定。4.初步观察mi R-218促进腱骨愈合的体内研究,为将来实现临床应用提供依据。方法:1.利用全骨髓贴壁的方法分离培养骨髓间充质干细胞MSCs,重组慢病毒编码Tob1短发夹RNA(sh RNA)转染大鼠骨髓间充质干细胞,获得Tob1基因缺失的MSCs稳转株(MSCs-sh Tob1),Real time RT-PCR和Western blot检测Tob1基因敲除效果,MTT法检测MSCs-sh Tob1细胞增殖能力,茜素红染色检测MSCs-sh Tob1成骨分化能力,油红O染色检测MSCs-sh Tob1成脂分化能力,流式细胞技术检测MSCs-sh Tob1细胞表面标志物。2.建立大鼠肩袖损伤重建模型,分为对照组、MSCs组和MSCs-sh Tob1组,分别混合生物蛋白胶注入重建的腱骨界面,术后4周、8周取材,通过测定最大载荷和刚度完成生物力学试验,通过固定后脱钙、石蜡包埋、切片、HE染色,完成组织学分析,通过实时定量q RT-PCR检测测定I和II型胶原蛋白的基因表达,从三个方面评价了骨髓间充质干细胞Tob1缺失对大鼠肩袖损伤修复模型腱骨愈合的影响。3.通过生物信息学实验以及对相关基因的检测,验证候选mi RNA是否对目的靶基因的表达产生影响。mi R-218 mimic和mi R-218 inhibitor转染骨髓间充质干细胞,转染48小时后,收获细胞进行进一步的分析。通过QRT-PCR检测mi R-218对Tob1m RNA表达水平检测,以确定mi R-218对Tob1 m RNA的影响,Western Blot检测mi R-218对Tob1蛋白表达水平,以确定mi R-218对Tob1蛋白表达的影响。4.mi R-218慢病毒载体的构建、包装,转染骨髓间充质干细胞,q RT-PCR检测mi R-218的表达水平,Western blot检测mi R-218对Tob1蛋白表达的影响,建立大鼠肩袖损伤重建模型,分为对照组、MSCs组和MSCs+mi R-218组,分别混合生物蛋白胶注入重建的腱骨界面,术后8周取材,通过测定最大载荷和刚度完成生物力学试验,通过固定后脱钙、石蜡包埋、切片、HE染色,完成组织学分析,从两个方面评价了mi R-218对大鼠肩袖损伤修复模型腱骨愈合的影响。结果:1.重组慢病毒编码Tob1短发夹RNA(sh RNA)转染大鼠骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR检测,发现感染MSCs后能有效下调内源性Tob1的表达,Western blot检测发现Tob1-sh RNA组有效地降低了Tob1在骨髓间充质干细胞的表达。MTT法检测细胞活性发现沉默Tob1显著增加MSCs的增殖活性。茜素红染色和油红O染色发现MSCs-sh Tob1仍有成骨、成脂等多向分化潜能,流式细胞仪检测发现高表达间充质干细胞表面标志物CD29和CD44,不表达造血干细胞标志物CD34和CD45。表明MSCs-sh Tob1没有改变间充质干细胞的细胞表型。2.SD大鼠行冈上肌腱切断和修复。术后4周的MSCs-sh Tob1组最大载荷明显高于对照组和MSCs组(P0.05),然而三组间的刚度没有统计学差异(P0.05)。在8周,MSCs-sh Tob1组最大载荷仍最高(P0.05),并且刚度明显高于对照组和MSCs组(P0.05)。HE染色,术后4周,对照组显示腱骨界面主要由成纤维细胞骨之间的松散纤维,无软骨或胶原纤维。在MSCs组和MSCs-sh Tob1组,腱骨交界处界面可见少量的软骨样细胞。然而三组之间没有显著的差异。术后8周时,对照组胶原纤维稀疏、杂乱的。MSCs组与对照组比,有更多的垂直的胶原纤维相似Sharpey纤维,少量的软骨细胞。MSCs-sh Tob1组发现更多的软骨细胞和纤维软骨。软骨细胞规整、成串排列。通过实时聚合酶链反应检测损伤的肌腱骨连接处Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达。第4周:MSCs-sh Tob1组中的I型胶原蛋白表达量较对照组和MSCs组有明显提高;而II型胶原蛋白没明显变化。第8周:MSCs-sh Tob1组中的I型胶原蛋白和II型胶原蛋白都有显著提高(P0.05)。3.通过在线数据库Target Scan 6.2与mi Randa分析,发现Tob1 3′UTR(170 177 bp处)上含有一个保守的mi R-218结合位点,我们克隆了Tob13′UTR序列的荧光素酶基因下游,获得3′Tob1 UTR。荧光素酶报告基因检测结果显示mi R-218转染后的3′Tob1UTR,相对荧光素酶活性明显降低。mi R-218 mimic和mi R-218 inhibitor对Tob1 m RNA无明显影响,mi R-218mimic导致Tob1蛋白明显下调,而mi R-218 inhibitor抑制剂上调Tob1蛋白表达。这些结果提示Tob1是mi R-218的直接目标。4.mi R-218慢病毒感染MSCs细胞,实时PCR证实高度上调表达mi R-218,而Tob1蛋白水平明显下调。SD大鼠行冈上肌腱切断和修复。术后8周,MSCs+mi R-218组较对照组和MSCs组最大载荷及刚度均有明显提高(P0.05),与对照组及MSCs组比较有更多排列更规整的胶原纤维和软骨细胞出现(P0.05)。可见MSCs+mi R-218有更好的促腱骨愈合作用。结论:本研究显示骨髓间充质干细胞Tob1缺失有效改善了大鼠肩袖损伤修复模型的腱骨愈合,首次发现了Tob1的上游调控因子mi R-218,并证明Tob1的表达可被mi R-218调控。过表达mi R-218有效促进大鼠模型的腱骨愈合,类似于Tob1缺失的影响。这些发现为骨髓间充质干细胞在提高腱骨愈合中的应用提供了理论依据。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) on bone healing . The effects of mi R - 218 and mi R - 218 inhibitor on the expression of Tob1 protein were determined . The results showed that MSCs - sh Tob1 had no effect on the expression of Tob1 protein . Western blot analysis showed that MSCs - sh Tob1 could effectively downregulate the expression of Tob1 protein . Western blot showed that MSCs - sh Tob1 could effectively reduce the expression of Tob1 protein . MSCs-sh Tob1缁勬渶澶ц浇鑽蜂粛鏈，

本文编号：1785973