氨导致的线粒体损伤对肝细胞凋亡和胆红素转运相关蛋白MRP2的影响

发布时间：2018-04-26 23:30

  本文选题：氨 + 肝细胞　； 参考：《郑州大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景：肝功能衰竭(hepatic failure,HF)定义为由于严重而广泛的肝细胞损伤导致的全身代谢功能发生紊乱的临床综合症状。常伴有大量肝细胞坏死、血氨的恶性升高、严重的消化道症状、黄疸迅速加深、出血、脑水肿和肺水肿甚至肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)[1]。肝性脑病病情严重、临床症状复杂、病死率高,是严重的危害人们健康的肝脏疾病。而代谢紊乱引起的氨中毒学说一直在肝性脑病的发病机制中处于核心地位。同时,氨在HE的诊断、治疗中也有十分重要的作用。细胞凋亡与线粒体细胞的凋亡是在一系列调控基因的参与下精确有序完成的,与细胞的增殖相类似。总体来讲,根据凋亡过程中是否有线粒体的参与,可将细胞的凋亡分为两条主要途径:一条是由细胞外信号激活细胞内的caspase来完成的;另一条途径是通过线粒体的激活诱导的caspase的释放,而活化的caspase可降解细胞内与代谢相关的重要蛋白,最终引发细胞凋亡。在线粒体凋亡途径中,细胞色素c(cyt c)从线粒体释放到细胞质中是凋亡发生的重要标志。Cyt c激活释放到细胞质后可与Apaf-1、caspase-9的前体、ATP/d ATP形成凋亡体。凋亡体形成后募集并激活caspase-3,诱发caspases介导的级联反应,最终发生凋亡。以往诸多研究证实线粒体MPT和线粒体上Bcl-2家族形成的跨膜通道介导了cyt c从线粒体到胞质的释放过程。在细胞凋亡或坏死时,膜通道孔的开放显著改变了线粒体的通透性线粒体内容物通过膜孔道释放到胞浆中。Ca2+过度进入,线粒体还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione Tablets,GSH)的氧化,和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的持续上升导致了膜通道的开放。过度开放的通道孔最终导致了线粒体Cyt c的释放和膜电位的消失。在线粒体膜上,以腺苷转位蛋白(ANT)和电压依赖性的的阴离子通道(VDAC)这两种蛋白为主组成了线粒体通透性转换孔(m PTP孔),m PTP孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和细胞色素c释放,导致细胞凋亡。线粒体功能密切相关的通透性转换孔(m PTP),ATP的合成,被认为是与氨的浓度升高及ROS的产生有关[2]。最近的研究表明生理浓度的氨可以使培养的星形胶质细胞中自由基的产生显著增加[3]。在急性氨中毒的动物模型中也显示出超氧化物产生的增加和各种抗氧化酶活性的下降[4]。氧化应激的后果之一就是导致线粒体内膜上以钙离子依赖为特征的m PTP孔的开放。因此钙离子浓度的改变可能是诱导m PTP孔开放的非常重要的原因。氧化应激可通过启动膜脂质过氧化来改变生物膜功能、或与生物大分子结合来破坏酶的活性等。在细胞因子(如TNF-α、NF-κB)的共同作用下不同程度的损伤肝细胞,所以抗氧化治疗对防治肝脏疾病起着重要的作用。胆红素的代谢与转运胆红素经肝细胞的清除是一个复杂的过程,游离胆红素(UCB)首先通过OATP1B1和OATP1B3被肝细胞摄取,再经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine-diphosphoglucuronosy transferase,UGT)的催化转变为直接胆红素(DBIL),最终DBIL通过细胞表面的多药耐药相关蛋白(MRP)排泄入胆汁。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)是大部分脊椎动物肝脏微粒体中最重要的II相生物转化酶之一。其中UTG1A1和UTG1A5被称为胆红素的代谢群,而UGT1A1是催化胆红素葡萄糖醛酸结合反应的主要酶,而UTG1A5在肝脏中的含量甚微。胆红素向细胞外的排泄过程严格依赖能量的供应和MRP蛋白及GSH的参与。高氨血症和黄疸是肝衰竭(HF)的常见临床症状。在肝衰竭的治疗过程中发现:降氨的同时伴随有胆红素水平的下降。肝脏是体内氨代谢的主要场所,出现血氨升高时出现的“肝细胞无能”现象是肝衰竭后的常见病理现象。但是肝细胞内升高的氨如何影响肝细胞的病理生理过程?氨是否又促进了肝细胞的凋亡?氨通过何种途径影响了胆红素的代谢或转运?既往高血氨损害星形胶质细胞的机制很多,包括直接毒性作用,氧化应激,线粒体通透性转换和谷氨酰胺理论等。但关于氨如何加重肝细胞的损伤甚至凋亡的作用研究甚少。胆红素的代谢过程与能量的消耗紧密相关,而在许多肝性脑病模型中都证实氨对线粒体氧化损伤及能量代谢的干扰。目前证据提示氨可作用于线粒体中三羧酸循环和苹果氨酸-天冬氨酸穿梭酶,导致ATP的生成不足,发生氧化应激[5]。故推测氨可能抑制胆红素代谢相关的酶或者干扰肝细胞的能量供给来阻断胆红素的代谢与转运,从而导致其在体内的堆积。而血氨升高时出现的胆红素水平的升高亦可被认为是组织处于氧化应激状态的标志。既往已有文献表明血氨与肝衰竭患者的并发症及死亡率有很大程度的相关性,但并没有研究指出氨在急性肝衰竭发病机制中的地位和作用,以及氨对肝细胞损伤的机制和对胆红素的影响。本实验通过氨中毒的细胞模型的建立,揭示了氨通过对线粒体的损伤诱导了肝细胞的凋亡,通过阻断细胞的能量供给进而阻碍了胆红素向细胞外的排泄为氨毒性的进一步研究提供理论依据。目的:目的：1.通过不同浓度的NH4CL对人张氏肝细胞chang liver的MTT实验,初步证实氨对肝细胞的增殖毒性;2.通过相关指标的检测证实氨促进肝细胞凋亡的作用;3.揭示氨作用后肝细胞线粒体功能的损伤及氧化压力的存在;5.证明氨是通过对ATP合成的抑制阻碍了MRP2蛋白介导的DBIL的外排过程。方法:方法：1.培养正常人肝细胞系chang liver,MTT法比较不同浓度的NH4CL(5、10、20和40 mmol/L)作用后,人张氏肝细胞chang liver的增殖是否受到影响;2.蛋白免疫印迹技术检测氨作用后凋亡指标PARP的完整性,细胞免疫荧光检测caspase-3的激活,再结合TUNEL法多方面证实氨促进肝细胞凋亡的作用;3.Quantitative PCR检测氨作用后p53、TNFR m RNA的表达排除外源性的凋亡途径;4.流式细胞技术观测抗氧化剂SOD和GSH作用后活性氧物质ROS产生的变化,证明氨损伤过程中氧化压力的存在。5.TEM下观察线粒体超微结构的损伤和钙黄绿素-AM荧光探针法记录m PTP孔的开放情况;6.ELISA法测定肝细胞功能相关指标ALT、AST、COX、ATP及氧化还原指标GSH,并比较细胞内外DBIL的变化;7.Quantitative PCR和Western blotting技术比较HO-1、UGT1A1和MRP2的m RNA和蛋白的表达,证明氨对ATP合成的抑制阻碍DBIL向胞外的排结果：大于10 mmol/L的氯化铵作用于chang liver细胞时,随着时间的增加,其抑制率呈稳定的上升趋势,且光镜下可观察到细胞密度的降低和胞内的空泡化现象;当10 mmol/L氨作用于肝细胞48 h后PARP蛋白被剪切,同时caspase-3的激活和凋亡较明显,而40 mmol/L时由于死亡细胞过多,TNFR1和p53的m RNA在氯化铵作用前后无显著变化;10 mmol/L的氨处理chang liver细胞48 h后电镜下可观察到线粒体形态的改变:线粒体肿胀变圆,空泡变性,嵴紊乱;10 mmol/L NH4CL组的细胞上清液中12 h时GSH和ALT较对照组已出现显著升高(p0.000 1和p0.000 1),COX的升高和ATP生成量的下降在氨作用后24 h出现(p0.000 1和p0.05),提示肝实质细胞的损伤和氧化损伤的存在。而AST的显著升高在氨作用48 h后才出现,相对滞后;在10 mmol/L的NH4CL作用细胞24 h时图上可见活性氧物质ROS的量明显增加,SOD和GSH作用后ROS产生量出现了一定程度的下降;SOD和GSH在一定程度上抑制了氨诱导的肝细胞凋亡作用;在10 mmol/L的NH4CL组,ATP的合成较对照组明显下降;胞内出现了DBIL的积累同时胞外DBIL的水平下降;10 mmol/L的NH4CL作用后,UGT1A1的m RNA和蛋白质水平均较对照组升高,但是MRP2的水平却出现了显著的下降。而HO-1未发生显著性变化。ATP的加入使MRP2的m RNA和蛋白水平出现了显著的升高。结论:结论：1.10 mmol/L的氨诱导了肝细胞的凋亡且对肝细胞功能造成了明显的损伤;2.氨造成了肝细胞线粒体的氧化损伤及m PTP孔的开放;3.氨通过内源性的线粒体氧化损伤途径诱导了肝细胞的凋亡;4.氨中毒的肝细胞中胆红素的代谢和排泄受到影响;5.氨是通过阻断能量供给影响胆红素经MRP2蛋白的排泄。
[Abstract]:Background : Hepatic failure ( HF ) is defined as a clinical comprehensive symptom of the disorder of systemic metabolic function caused by severe and extensive hepatic injury . It is often accompanied by a large number of hepatocellular necrosis , malignant increase of blood ammonia , severe digestive tract symptoms , rapid jaundice , hemorrhage , cerebral edema and pulmonary edema and even hepatic encephalopathy ( HE ) . 鑲濇，

本文编号：1808187