CXCL12在大鼠创伤性脑损伤后所起作用的研究

发布时间：2018-05-09 05:36

  本文选题：创伤性脑损伤 + CXCL2　； 参考：《苏州大学》2013年博士论文

【摘要】：第一部分CXCL12增加Bcl-2/Bax的比率抑制大鼠创伤性脑损伤后皮质神经元的凋亡 目的： 探讨CXCL12对大鼠创伤性脑损伤(TBI)后皮质神经细胞凋亡的影响及相关机制。 方法： 1.采用颅脑液压损伤装置,制备大鼠创伤性脑损伤模型； 2.将实验大鼠分成四组：假手术组只开颅,不制备脑损伤模型,不注射任何试剂；对照组在损伤区周围皮质注射生理盐水；CXCL12治疗组注射CXCL12, CXCL12+AMD3100治疗组注射CXCL12+AMD3100o 3.伤后3天,TUNEL试剂盒检测各组神经细胞凋亡情况,TUNEL/NeuN。 TUNEL/GFAP荧光双标检测凋亡细胞类型,CXCR4/NeuN免疫荧光双标检测凋亡神经元CXCR4的表达情况,active caspase-3/NeuN、active caspase-3/GFAP、Bcl-2/NeuN、 Bcl-2/GFAP、Bax/NeuN、Bax/GFAP免疫荧光双标检测各组active caspase-3、Bcl-2、Bax的阳性细胞比例及所属细胞类型。 4. Western Blot检测各组active caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达变化。 5.实时PCR检测各组active caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达变化。 结果： 1.TBI后损伤区周围皮质出现的凋亡细胞以神经元为主,且凋亡的神经元可表达CXCR4;给予CXCL12治疗,相较于对照组,CXCL12下调了损伤区周围皮质神经元的凋亡指数(AI),CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较AJ重新升高,但仍低于对照组。 2. Caspase-3免疫荧光、Western Blot及实时PCR等结果为：CXCL12治疗组与对照组比较,active caspase-3表达下调,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较active caspase-3重新升高,但仍低于对照组。 3. Bcl-2、Bax免疫荧光、Western Blot及实时PCR等结果为：CXCL12治疗组与对照组比较,Bcl-2表达上调,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较Bcl-2有所下降,但仍高于对照组；CXCL12治疗组与对照组比较,Bax表达下调,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较Bax有所上升,但仍低于对照组；CXCL12治疗组与对照组比较,Bcl-2/Bax比率升高,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较Bcl-2/Bax比率有所下降,但仍高于对照组。 结论： 大鼠创伤性脑损伤后,给予CXCL12能抑制损伤区周围皮质神经元的凋亡,其作用机制与CXCL12/CXCR4轴提高Bcl-2/Bax比率,进而减少caspase-3的活化有关,而active caspase-3的减少,使得凋亡级联放大过程减轻,从而使得TBI后的神经元得以保护。 第二部分CXCL12促进大鼠创伤性脑损伤后神经前体细胞增殖及迁移 目的： 探讨CXCL12对大鼠创伤性脑损伤(TBI)后损伤区周围脑组织的神经前体细胞增殖、迁移的影响及相关机制。 方法： 1.采用颅脑液压损伤装置,制备大鼠创伤性脑损伤模型； 2.将实验大鼠分成四组：假手术组只开颅,不制备脑损伤模型,不注射任何试剂；对照组在损伤区周围皮质注射生理盐水；CXCL12治疗组注射CXCL12, CXCL12+AMD3100治疗组注射CXCL12+AMD3100。 3.伤后7天,检测BrdU/Nestin、BLBP/Nestin、BLBP/Vimentin、BLBP/SOX2、 BLBP/CXCR4、DCX/BLBP、DCX/BrdU、DCX/GFAP、DCX/NeuN、MMP-2/DCX. MMP-2/GFAP、MMP-2/NeuN免疫荧光双标情况；检测CXCR4/DCX免疫荧光双标情况及所占面积；检测MMP-2免疫荧光标记情况。 4. Western Blot检测各组Nestin、BLBP、、Vimentin、MMP-2蛋白表达变化。 5.实时PCR检测各组Nestin、BLBP、Vimentin、MMP-2mRNA表达变化。 6.体外培养胚鼠海马源性神经干细胞,BrdU/Nestin、SOX2/CXCR4免疫荧光检测其胚源性及增殖能力,GFAP、MAP-2、CNP检测其多分化潜能。 7.将神经干细胞分成三组进行分化培养,对照组中加入TBI脑组织提取液,CXCL12组加入TBI脑组织提取液和CXCL12, CXCL12+AMD3100组加入TBI脑组织提取液、CXCL12和AMD3100。DCX免疫荧光检测各组神经干细胞向DCX阳性细胞分化的比例。 结果： 1.体内实验免疫荧光结果为：CXCL12治疗组与对照组比较,在损伤区周围皮质及胼胝体部位BrdU/Nestin、BLBP/Nestin、BLBP/Vimentin双标阳性细胞增多,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较这些双标阳性细胞明显下降且低于对照组。Western Blot以及实时PCR结果与免疫荧光结果类似,Nestin、BLBP、Vimentin蛋白和mRNA的表达在给予CXCL12后明显升高,给予CXCL12+AMD3100后表达则下降且低于对照组。 2.损伤区周围皮质BLBP/Vimentin双标阳性细胞形态类似星形胶质细胞,而胼胝体部位BLBP/Vimentin双标阳性细胞大多具备较长双极突起,与放射状胶质细胞(RGCs)形态更吻合。BLBP阳性细胞还能表达CXCR4及SOX2。 3.在胼胝体部位CXCL12治疗组与对照组比较,CXCR4/DCX双标阳性细胞增多,所占面积增加,由链状分布演变为辐射状分布,在辐射状区域之外出现更多散在的CXCR4/DCX双标阳性细胞；CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较,这些双标阳性细胞数量及所占面积明显下降且低于对照组,DCX阳性细胞首尾相连关系缺失明显。 4.胼胝体部位只有少量的DCX/BLBP双标阳性细胞,大部分BLBP阳性细胞紧邻DCX阳性细胞；在DCX/BrdU免疫荧光双标实验中,部分DCX阳性细胞同时也为BrdU阳性细胞；DCX/GFAP免疫荧光双标结果表明,DCX阳性细胞紧贴GFAP阳性细胞的内侧；未观察到DCX/NeuN双标阳性细胞。 5.在脑损伤区CXCL12治疗组与对照组比较,MMP-2阳性细胞增多,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较,这些阳性细胞明显下降且低于对照组。Western Blot以及实时PCR结果与免疫荧光结果类似,MMP-2蛋白和mRNA的表达在给予CXCL12后明显升高,给予CXCL12+AMD3100后则表达下降且低于对照组。MMP-2/DCX、MMP-2/GFAP、MMP-2/NeuN免疫荧光双标结果表明,MMP-2可由DCX阳性细胞、GFAP阳性细胞和NeuN阳性神经元等细胞分泌。 6.体外神经干细胞分化培养,对照组、CXCL12组和CXCL12+AMD3100组向DCX阳性细胞的分化比例两两比较,差异无统计学意义。 结论： 大鼠创伤性脑损伤后,给予CXCL12通过结合CXCR4能促进神经前体细胞增殖,增殖的神经前体细胞为放射状胶质细胞样细胞,其中胼胝体部位增殖的放射状胶质细胞样细胞更具备放射状胶质细胞双极突起的形态学特征；CXCL12/CXCR4轴还能通过增加损伤区周围脑组织中多种细胞MMP-2的分泌促进不成熟神经元沿胼胝体迁移,不成熟神经元可以来源于放射状胶质细胞样细胞的分化,但CXCL12不能增加神经干细胞向不成熟神经元分化,不成熟神经元在胼胝体的迁移兼具切线迁移和放射状迁移特点。 第三部分CXCL12促进大鼠创伤性脑损伤后血管增生 目的： 探讨CXCL12对大鼠创伤性脑损伤(TBI)后损伤区周围脑组织血管增生的影响及相关机制。 方法： 1.采用颅脑液压损伤装置,制备大鼠创伤性脑损伤模型； 2.将实验大鼠分成四组：假手术组只开颅,不制备脑损伤模型,不注射任何试剂；对照组在损伤区周围皮质注射生理盐水；CXCL12治疗组注射CXCL12, CXCL12+AMD3100治疗组注射CXCL12+AMD3100。 3.伤后7天,检测CD31、vWF和VEGF免疫荧光情况,分别以CD31、vWF计算微血管密度(MVD),检测VEGF荧光强度(OD)。 4. Western Blot检测各组VEGF蛋白表达变化。 5.实时PCR检测各组VEGF mRNA表达变化。 结果： 1. CXCL12治疗组与对照组比较,MVD (CD31)、MVD (vWF)增高,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较MVD (CD31)、MVD (vWF)下降且低于对照组。 2. CXCL12治疗组与对照组比较,VEGF OD值升高,CXCL12+AMD3100治疗组与CXCL12治疗组比较下降且低于对照组。 3. Western Blot以及实时PCR结果为,VEGF蛋白和mRNA的表达在给予CXCL12后明显升高,给予CXCL12+AMD3100后则表达下降且低于对照组。 结论： 大鼠创伤性脑损伤后,给予CXCL12能促进损伤区周围微血管增生,其作用机制与CXCL12/CXCR4轴提高损伤区局部组织VEGF的分泌,进而增强血管的增生有关。
[Abstract]:Part CXCL12 increased the ratio of Bcl-2/Bax to inhibit the apoptosis of cortical neurons after traumatic brain injury in rats.
Objective:
Objective to investigate the effect of CXCL12 on apoptosis of cortical neurons after traumatic brain injury (TBI) in rats and its mechanism.
Method锛，

本文编号：1864801