Cdc42在急性肺损伤中对肺微血管内皮细胞再生修复的影响及机制

发布时间：2018-05-14 04:08

  本文选题：急性肺损伤/急性呼吸窘迫症 + 肺微血管损伤和修复　； 参考：《南方医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合症(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是呼吸系统常见危重症之一,对人类的健康和生产生活造成了严重的影响。目前,临床上治疗措施有限,死亡率居高不下。因此,探索ALI/ARDS的发病机制,寻求治疗手段的新途径,具有非常重要的现实意义。ALI/ARDS的病理生理特征主要是肺内的炎症反应以及毛细血管膜破损导致的肺水肿,在此过程中,肺微血管内皮细胞细胞最早受到伤害,是ALI/ARDS发病的关键环节。因此,促进受损的肺微血管内皮细胞再生,对修复微血管完整性,减轻肺组织炎性渗出,延缓肺损伤进一步发展具有重要意义。而促进血管再生修复的机制十分复杂,目前,研究者们仍然在不断探索与肺微血管内皮再生能力相关的调控因素,籍此找到潜在的治疗靶点。细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42),简称Cdc42,是Rho家族蛋白中的重要成员,分子量大小为25KD。它具有很多非常重要的生物学活性,例如调控细胞周期、促进细胞增殖、迁移,维持细胞极性等等。近年来,研究者们利用Cre/Loxp条件性基因敲除技术构建动物体内特定器官或组织上敲除Cdc42基因的模型,来探索Cdc42的调控作用及机制。在本课题中,我们利用该技术构建了全身血管内皮特异性敲除Cdc42基因的小鼠,首次探索了 Cdc42在急性肺损伤中对肺微血管血管内皮损伤与修复的影响及机制,旨在发现能够促进血管修复、改善ALI损伤程度的有效治疗手段。研究方法:1.体内实验:1.1 pull-down实验检测急性肺损伤中肺组织的Cdc42活性水平。1.2利用cre/loxp技术构建血管内皮特异性敲除Cdc42基因小鼠模型,并在此基础上再建立急性肺损伤,进行以下实验步骤。1.3所有小鼠收集左肺组织进行固定、脱水、包埋,随后进行HE及病理评分,免疫组化染色观察血管内皮增殖作用;右肺收集后提取蛋白,进行western blot实验检测Cdc42蛋白表达水平。2.体外实验2.1培养原代肺微管内皮细胞,利用cre/loxp技术构建敲除Cdc42基因细胞模型。2.2选用人肺微血管内皮细胞系,利用小RNA干扰技术敲低Cdc42表达;在构建好的细胞模型中,用BrdU检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,细胞跨膜电阻(TEER)和异硫氰酸荧光素一右旋糖苷透过率(FITC-Dextran)评价细胞屏障功能,用Matrigel实验检测细胞形成血管能力。2.3提取细胞蛋白,进行western blot分析,检测Cdc42下游相关信号通路的变化。3.相关数据统计分析。研究结果:1.ALI中肺组织Cdc42活性水平表达LPS损伤处理后,肺组织中Cdc42GTP的表达水平有明显改变。对比LPS未处理组(正常组),LPS1d组Cdc42GTP表达有所下降,LPS处理后7天组的Cdc42GTP表达显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。2.稳定构建了血管内皮细胞特异性敲除Cdc42基因的动物和原代细胞模型构建动物模型后,敲除组的肺组织中Cdc42蛋白表达明显小于未敲除组,差异有统计学意义(P0.05)。原代肺微血管细胞模型中,腺病毒敲除组的Cdc42蛋白表达同样小于对照组。3.稳定构建了敲低Cdc42水平的HPMVE细胞系。HPMVEC转染siControl质粒及siCdc42质粒后,三个siCdc42都能抑制Cdc42蛋白表达,差异有统计学意义(P0.05)。4.动物水平上,在小鼠血管内皮细胞上Cdc42基因敲除对ALI后炎性细胞浸润、微血管渗漏以及肺微血管增殖能力的影响Cdc42敲除组的ALI损伤评分、肺血管周围中性粒细胞浸润程度、肺微血管漏出率都明显大于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,敲除组血管增殖能力明显下降。5.敲低HPMVEC中Cdc42水平对细胞增殖、迁移、成管等的影响与对照组相比,siCdc42组的血管内皮增殖、迁移和血管成型能力明显下降,差异有统计学意义。(P0.05)。6.敲低细胞中Cdc42表达水平可以下调PAK1/Akt信号通路的表达水平。敲低Cdc42后,减少了 PAK1、AKT的磷酸化及总量表达,并下调了VE-cadherin蛋白表达,对p-JNK/JNK、p-P38/P38等的表达无影响。研究结论:1.Cdc42与肺炎性损伤的关系:Cdc42的缺失加重了 ALI中的炎性细胞浸润、肺微血管渗漏,破坏肺微血管屏障功能。因而Cdc42有可能成为改善ALI/ARDS的治疗靶点。2.Cdc42与肺微血管再生修复作用的关系:体内实验证实,敲除Cdc42基因降低了肺微血管增殖能力;体外实验证实,下调Cdc42表达水平降低了肺微血管内皮细胞增殖、迁移、成管等一系列血管再生修复的能力。因此Cdc42是肺微血管内皮细胞损伤后再生修复的重要调控因子。3.Cdc42调控ALI中肺微血管细胞再生修复的机制:下调Cdc42表达水平降低了 PAK1/AKT信号通路的表达水平,因此Cdc42可能是通过PAK1/Akt信号通路来发挥调控作用。
[Abstract]:Acute lung injury ( ALI ) and acute respiratory distress syndrome ( ARDS ) are one of the most common causes of acute respiratory distress syndrome ( ARDS ) . The expression of Cdc42 protein in lung tissue was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . Cdc42 is an important regulation factor for the regeneration and repair of pulmonary microvascular endothelial cells ( ALI / ARDS ) .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563.8

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本文编号：1886250