创伤脓毒症遗传易感性的分子流行病学与临床关联研究

发布时间：2018-05-20 23:38

  本文选题：创伤 + 脓毒症　； 参考：《第三军医大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景 创伤是严重危害人类健康的公共卫生难题，是45岁以下人群的主要死亡原因。创伤引发的脓毒症和多器官功能障碍(MODS)等并发症是患者死亡的严重威胁。因此，如何尽早甄别出罹患脓毒症和MODS的高危患者，给予及早预防和针对性治疗是提高严重创伤患者预后的关键。临床和实验研究表明创伤后机体的免疫应答反应具有个体异质性，创伤脓毒症和MODS的发生与机体遗传背景尤其是单核甘酸多态性存在密切的内在联系，即不同遗传背景的创伤个体，存在脓毒症易患性、临床严重程度与预后及治疗反应的差异性。因此，从遗传背景着手深入研究创伤后的炎症反应规律、脓毒症发生发展的相关遗传信息，将为评估和预警创伤脓毒症的发生风险性、治疗反应或预后建立有效、快捷的分子遗传学诊断指标和技术。 本研究目的是探索和发现创伤脓毒症易患性相关的基因多态性。首先基于已发表的脓毒症遗传关联研究，从循证医学角度进行系统评价和meta分析，全面、充分理解脓毒症发生的遗传背景；其次采用候选基因策略选择一些重要的免疫炎症调控基因在临床多中心创伤人群中继续探索新的脓毒症高危基因多态性位点及其生物学功能，为探索创伤脓毒症预警诊断方法提供依据。 材料与方法 1.采用(sepsis OR "septic shock" OR septicemia) AND (polymorphism OR variationOR mutation)关键词在Pubmed、Medline、Embase、Web of Science和HuGE等医学文献数据库中检索和筛选基因多态性与脓毒症发生风险的遗传关联研究相关文献，针对≥2个研究人群的基因多态性位点在显性模式、隐性模式和等位基因模式下采用meta分析方法评估与脓毒症发生风险的关联强度，并根据人群种族进行分层分析。最后采用异质性分析、敏感性分析、发表偏倚检验和威尼斯等级标准评价关联结果的可靠性和稳定性。 2.从HapMap数据库下载NLRP3、SOCSs和microRNAs全基因及其延伸范围内的SNP在中国北京汉族人群中的基因型数据，采用TAGster软件计算连锁不平衡r2值（r2≥0.8）和构建单倍型bin图谱，从每一个bin内挑选一个能够代表整个bin内SNP信息的标签SNP。此外，通过miRNA二级结构构象和靶基因预测分析挑选具有潜在功能性的pre-miRNASNP。 3.在连续收集的1408例(重庆地区806例、云南地区286例、浙江地区316例)中国汉族严重创伤患者中采用焦磷酸测序法进行SNP位点的基因型检测。计数各SNP的基因型分布，采用卡方检验计算哈温平衡、显/隐性遗传模式下各基因型与脓毒症发生率之间的关系，单因素方差分析各基因型与MOD评分的关系，logistic回归和线性回归分别分析SNP与创伤后脓毒症或MOD评分之间的等位基因剂量效应，并进行年龄、性别及ISS等混杂因素的校正。 4.采集创伤后2小时内和健康自愿者外周血，在37℃条件下LPS（100ng/ml）孵育4小时，分离血浆和白细胞。采用ELISA检测创伤患者血浆中细胞因子的表达水平，采用Real-time PCR检测LPS刺激的健康自愿者外周血细胞中CIS表达水平 5.通过构建野生型和突变型含有rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T的NLRP3或CIS启动子的pGL3质粒，转染人类模式细胞系，采用荧光素酶报告基因系统观察rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T分别对靶基因NLRP3、CIS启动子活性影响。相似的，通过构建野生型和突变型的miR-608表达载体、转染细胞和TaqMan探针法观察rs4919510G/C对成熟miR-608的表达影响。 结果 1.按照预定的纳入标准从8796篇文献中筛选出232篇脓毒症遗传关联研究。对56个基因123个多态性位点的meta分析发现17个基因21个多态性位点在不同的遗传模式下与脓毒症发生率密切相关，其中强关联位点5个，分别是NOD2rs2066844C/T、LBP rs2232618T/C、TNFA rs361525G/A、IL-10rs1800894、SETPDrs12219080；中等关联强度位点6个，分别是TLR1rs5743611G/C、RAGE rs1800625T/C、MD2rs11465996C/G、IL-12B rs2195940、PBEF rs61330082T/C、SFTPD rs1998374。根据流行病学累计证据等级划分没有基因多态性位点的证据等级达到强度，5个位点为中等，，其余位点为微弱等级。通过亚组分析额外发现IL-10rs1800896在亚洲人群中与脓毒症发生风险呈较弱关联性，流行病学累计证据等级为微弱等级。此外，对仅有一组研究数据的94个基因177个多态性位点分析发现31个基因的42个多态性位点与脓毒症发生风险密切相关，这些关联性需要更大研究人群和检验功效的研究去证实。 2.基于中国北京汉族人群中的SNP基因型数据，通过构建单倍型bin图谱从35个NLRP3SNPs中挑选6个标签SNP；采用相同的方法根据连锁不平衡强度（r2值）从7个SOCS基因145个SNPs中挑选12个标签SNP。此外，通过miRNA二级结构和靶基因预测分析从26个pre-miRNA SNPs中挑选9个潜在功能性的SNP。总计在NLRP3、SOCSs和pre-miRNA基因范围内挑选出27个具有代表性和潜在功能性的SNP。 3.在6个NLRP3标签SNP中，在重庆创伤人群中两个SNP（srs2027432-1017G/A、rs12048215+5134A/G)与创伤脓毒症和MODS的发生密切相关，显示A等位基因携带者创伤后发生脓毒症和MODS的机率明显增高，LPS诱导的血浆IL-1β表达升高；但两个SNP并无协同效应。此外，通过荧光素酶报告实验也证实-1017A等位基因显著增强NLRP3启动子活性。 4.在12个SOCS标签SNP中，在重庆和浙江创伤人群中CIS基因的rs414171-237A→T和SOCS7rs3748726+49083T→C单独和协同地降低创伤后脓毒症和MODS发生风险，其中CIS-237T能够降低血浆促炎细胞因子TNF-α和增加抗炎细胞因子IL-10的表达水平，同时降低LPS诱导的外周血白细胞CIS表达；荧光素酶报告实验也证实-237T减弱CIS启动活性。 5.在9个筛选出的潜在功能性miRNA SNPs中。仅有miR-608rs4919510C等位基因在重庆、云南和浙江三个创伤人群中明显增加创伤后脓毒症和MODS的发生，且将三个人群合并后的关联强度更大。基因型-表型分析发现rs4919510C显著降低抗炎细胞因子和增加促炎细胞因子的表达，体外实验也证实G→C增强成熟miR-608表达水平。 结论 本课题首次针对已发表的脓毒症易患性遗传关联研究进行较为系统、全面的meta分析阐明脓毒症发生风险的高危基因多态性位点。同时通过临床多中心创伤患者的遗传关联研究发现NLRP3rs2027432、rs12048215，CIS rs414171，SOCS7rs3748726和miR-608rs4919510等5个新的与创伤后脓毒症或MODS发生密切相关的基因多态性位点。为探寻创伤脓毒症的分子遗传学诊断方法，以及开展创伤个体化治疗提供了系列有重要临床价值的遗传标志物
[Abstract]:Background of the study

Trauma is a public health problem which is seriously harmful to human health . It is the main cause of death of people under 45 years of age . The complications such as sepsis and multiple organ dysfunction syndrome ( MODS ) are the key to the death of patients . Therefore , it is suggested that early prevention and targeted therapy are the key to improve the prognosis of patients with severe trauma .

The purpose of this study was to explore and detect genetic polymorphisms associated with susceptibility to trauma sepsis . First , based on published sepsis genetic association studies , systematic evaluation and meta - analysis were conducted from evidence - based medical perspectives to fully understand the genetic background of sepsis .
Secondly , we use the candidate gene strategy to select some important immune inflammatory regulatory genes to continue to explore new sepsis high - risk gene polymorphism sites and their biological functions in the clinical multi - center wound population , and provide the basis for the exploration of early warning diagnostic methods for wound sepsis .

Materials and Methods

1 . To search and screen genetic association between genetic polymorphism and risk of sepsis in medical literature database such as Pubmed , Medline , Embase , Web of Science and HuGE by using ( sepsis OR " septic shock " OR polymorphism ) and ( polymorphism OR variationOR mutation ) keyword .

2 . The genotype data of NLRP3 , SOCSs and microRNAs in Beijing Han population were downloaded from HapMap database . Using TAGster software to calculate linkage disequilibrium r2 ( r2 鈮

本文编号：1916766