CLC-3调节表皮干细胞迁移修复皮肤创面作用的研究

发布时间：2018-06-16 21:22

本文选题：表皮干细胞 + CLC-3氯通道蛋白　；参考：《第三军医大学》2016年博士论文

【摘要】：背景和目的:当创伤发生时,如果组织的完整和内部平衡重建,体内多种细胞内和细胞间的路径会被激活并相互协调(1)。研究发现表皮干细胞ESCs能够从表皮或表皮与皮脂腺间毛囊处漏斗管迁移参与表皮修复(1-5)。然而对此创面愈合复杂生理过程的影响因素仍知之甚少。因为缺乏对控制表皮干细胞体积和创伤后迁移运动影响因素的进一步研究,这方面的研究知识很少。有研究报道在肿瘤发育和侵袭中,膜离子通道在肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡中起重要作用(6)。电压门控性钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道在乳腺癌(7)、黑色素瘤(8)、纤维肉瘤(9)的肿瘤侵袭和细胞迁移中起作用。氯离子通道是体内最重要的阴离子通道,基于它的门控机制,氯离子通道可以被分成五个亚型,其中之一是容积激活性氯离子通道(VACC)(10)。容积激活性氯离子通道(VACC)对因受渗透性的细胞肿胀刺激产生的容积激活性氯离子电流变化(ICl,vol)负有责任。通过VACC的氯离子和钾离子外流同钾离子通道一起导致被称为调节性体积减小(RVD)的细胞体积变小(11,12)。VACC变化已经确定在神经胶质瘤细胞迁移中起重要作用(13,14)。尽管目前对于主要负责提供容积激活性氯离子电流(ICl,vol)的通道蛋白仍然不确定,CLC-3,作为电压门控性氯离子通道CLC家族中的一员,是重要分子候选蛋白之一(15-17)。CLC-3是激活和调节容积激活性氯离子电流(ICl,vol)的分子成分(18,19)。在很多肿瘤细胞中它的蛋白表达得到确定,包括前列腺癌上皮细胞(20)、神经胶质瘤细胞(21)、PC12细胞(22)和CNE-2Z细胞(23)。大量研究重点放在了氯离子通道的表达及其在细胞迁移和侵袭中发挥作用上。问题是表皮干细胞上是否有CLC-3氯通道蛋白表达,如果有,CLC-3氯通道蛋白是否通过容积激活性氯离子电流(ICl,vol)或调节性体积减小(RVD)来调节表皮干细胞的细胞体积变化。创面修复过程中表皮干细胞迁移时CLC-3氯通道蛋白作用也没有在皮肤切除模型中研究过。因此,我们对表皮干细胞上CLC-3氯通道蛋白表达及容积激活性氯离子通道(VACC)功能作用进行了研究,使用RNA干扰抑制CLC-3氯通道蛋白表达来评估CLC-3氯通道蛋白在表皮干细胞迁移中的作用。本课题主要就表皮干细胞迁移的“内在动力”作为切入点,对clc-3氯通道蛋白在表皮干细胞迁移运动中的作用进行初步研究。我们对表皮干细胞迁移运动中clc-3氯通道蛋白所起调节作用的研究,将有助于寻找介入表皮干细胞迁移的靶点和挖掘有效促进创面愈合治疗措施。方法:1在体外培养的正常大鼠表皮干细胞中提取总rna,并用rt-pcr方法检测clc-3氯通道mrna在正常大鼠表皮干细胞上的表达。2westernblotting方法检测clc-3蛋白在正常大鼠表皮干细胞上的表达。3在体外培养的正常大鼠表皮干细胞上经过免疫荧光方法观察clc-3氯通道蛋白是否表达。4免疫荧光方法检测正常sd大鼠皮肤表皮干细胞分布情况及clc-3氯通道蛋白表达情况。免疫荧光双标染色观察正常大鼠急性皮肤伤切除模型创面愈合过程中创缘表皮干细胞分布情况及clc-3氯通道蛋白表达情况。5clc-3过表达及抑制表达载体构建、转染表皮干细胞及对表皮干细胞clc-3的影响。6clc-3过表达及抑制表达载体转染的表皮干细胞容积敏感性氯电流变化情况。7clc-3过表达及抑制表达载体转染表皮干细胞对表皮干细胞迁移运动能力的影响。8活细胞工作站技术动态观察clc-3过表达及抑制表达载体转染表皮干细胞后对表皮干细胞瞬时速度和运动轨迹长度的影响。结果:1在体外培养的正常大鼠表皮干细胞中提取总rna,并用rt-pcr方法检测发现clc-3氯通道mrna在正常大鼠表皮干细胞上表达。经1%琼脂糖凝胶电泳发现,阴性对照组无条带,而表皮干细胞在电泳结果上出现一条特异扩增条带,位置为200bp,表明clc-3氯通道mrna在正常大鼠表皮干细胞上表达。2westernblotting方法检测发现clc-3蛋白在正常大鼠表皮干细胞上表达。检测到一条分子量为92kda的clc-3蛋白在正常大鼠表皮干细胞上的表达。3在体外培养的正常大鼠表皮干细胞经过免疫荧光方法观察发现clc-3氯通道蛋白在正常大鼠表皮干细胞上表达。可以看到胞膜、胞浆有红色荧光的阳性表达,表明正常大鼠表皮干细胞上有clc-3氯通道蛋白表达,定位于胞膜、胞浆。4免疫荧光方法检测正常sd大鼠皮肤clc-3氯通道蛋白情况,我们选用一直被研究者公认并采用的标记物β1整合素作为escs的阳性筛选标记(绿色荧光),与clc-3氯通道蛋白共定位,结果显示可见表皮基底层细胞排列规则,整齐,表皮基底层细胞体积正常,细胞浆荧光强度弱,胞膜、胞浆有红色荧光的阳性表达。表明正常大鼠皮肤表皮上有clc-3氯通道蛋白表达。免疫荧光双标染色观察正常大鼠急性皮肤伤切除模型创面愈合过程中创缘表皮干细胞分布情况及clc-3氯通道蛋白的表达,标记物β1整合素作为escs的阳性筛选标记(绿色荧光),与clc-3氯通道蛋白(红色荧光)共定位,致伤后1天,我们看到创缘部位表皮层没有出现明显的荧光增强现象,表皮层没有增厚,但能够在创缘附近表皮层中看到有少量膜荧光较强的细胞。致伤后3天时,创缘胞膜荧光阳性表达细胞明显增多,创缘表皮层增厚。致伤后7天时,创缘部位表皮基底层细胞形态仍不规则,依然处于旺盛的增殖分裂状态,创缘胞膜荧光阳性表达细胞荧光略微减弱,创缘部位表皮层厚,细胞数量多。致伤后10天时,创缘部位表皮基底层细胞排列逐渐紧密,细胞形态变得规则整齐,创缘胞膜荧光阳性表达细胞荧光进一步减弱,创缘部位表皮层变薄,细胞数量减少。5clc-3表达及抑制表达载体构建、转染表皮干细胞及对表皮干细胞clc-3的影响。荧光显微镜镜下观察表皮干细胞形态及感染效率,可以看到感染慢病毒的表皮干细胞生长状况良好,形态正常,rna干扰靶点病毒感染效率均高于90%。real-timepcr检测最优靶点mrna的敲除效率基因表达变化分析结果,westernblot检测最优靶点蛋白水平的敲除效率蛋白表达变化分析结果,转染clcn3表达病毒后,clcn3蛋白水平有所上升。clcn3sh2和clcn3sh3都能有效降低clcn3氯通道蛋白表达水平,而clcn3sh1和control组相比对clcn3氯通道蛋白表达水平影响没有显著差异(p0.05),而clcn3sh2干扰序列能够最有效的干扰clcn3基因的转录。clcn3sh2干扰序列能够有效的抑制clcn3蛋白的表达。6clc-3过表达及抑制表达载体转染的表皮干细胞容积敏感性氯电流变化情况。我们应用全细胞膜片钳技术对表皮干细胞容积敏感性氯电流变化情况进行了检测,我们对大鼠表皮干细胞等渗状态下、lv-clc3-nc组、lv-clc3-overexpression组、lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞低渗状态下的电压-电流关系进行了分析,当lv-clc3-nc组、lv-clc3-overexpression组、lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞容积敏感性氯电流受低渗外液刺激被激活后,lv-clc3-overexpression组较lv-clc3-nc组、lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞不同钳制电压的电流值更高,波动更明显。而lv-clc3-sh组低于lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞不同钳制电压的电流值,波动不明显。我们对膜电位钳制于+100mv时的细胞平均电流密度值进行了统计分析,分析发现,当膜电位钳制于+100mv时,lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞容积敏感性氯电流平均电流密度值为722.77±21.57pa,lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞容积敏感性氯电流平均电流密度值为1257.39±41.58pa,显著高于lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞容积敏感性氯电流平均电流密度值为722.77±21.57pa(p0.01)。lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞容积敏感性氯电流平均电流密度值为367.43±18.41pa,显著低于lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞容积敏感性氯电流平均电流密度值为722.77±21.57pa和lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞容积敏感性氯电流平均电流密度值为1257.39±41.58pa(p0.01)。7clc-3过表达及抑制表达载体转染表皮干细胞对表皮干细胞迁移运动能力的影响。细胞划痕实验显示,lv-clc3-nc组、lv-clc3-overexpression组、lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞的细胞迁移运动能力是不同的,我们分别对lv-clc3-nc组、lv-clc3-overexpression组、lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞划痕创面间距离比较进行了统计分析,分析发现,lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞划痕创面间距离平均值为428.78±2.62μm,lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞划痕创面间距离平均值为585.39±1.83μm,显著高于lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞划痕创面间距离平均值为428.78±2.62μm(p0.01)。lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞划痕创面间距离平均值为316.89±2.43μm,显著低于大鼠表皮干细胞划痕创面间距离平均值为428.78±2.62μm和lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞划痕创面间距离平均值为585.39±1.83μm(p0.01)。说明lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞细胞表达clc-3增高,迁移运动能力增强;而lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞表达clc-3降低,迁移运动能力减弱。细胞transwell实验检测lv-clc3-nc组、lv-clc3-overexpression组、lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞的细胞迁移运动能力,我们分别对lv-clc3-nc组、lv-clc3-overexpression组、lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞进入下室细胞数比较进行了统计分析,分析发现,lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞进入下室细胞数平均值为209.11±2.47,lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞进入下室细胞数平均值为282.50±2.57,显著高于lv-clc3-nc组大鼠表皮干细胞进入下室细胞数平均值209.11±2.47(p0.01)。lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞进入下室细胞数平均值为163.50±2.79,显著低于大鼠表皮干细胞进入下室细胞数平均值为209.11±2.47和lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞进入下室细胞数平均值为282.50±2.57(p0.01)。说明lv-clc3-overexpression组大鼠表皮干细胞表达clc-3增高,迁移运动能力增强;而lv-clc3-sh组大鼠表皮干细胞表达clc-3降低,迁移运动能力减弱。8活细胞工作站技术动态观察CLC-3过表达及抑制表达载体转染表皮干细胞后对表皮干细胞瞬时速度和运动轨迹长度的影响。活细胞工作站(live cell station,LCS)动态观察Lv-CLC3-NC组、Lv-CLC3-over expression组、Lv-CLC3-sh组大鼠表皮干细胞运动情况,我们使用IMARIS软件对活细胞工作站(live cell station,LCS)采集数据进行分析,Lv-CLC3-NC组、Lv-CLC3-over expression组、Lv-CLC3-sh组大鼠表皮干细胞细胞运动瞬时速度变化情况。我们可以看到Lv-CLC3-over expression组大鼠表皮干细胞相比于Lv-CLC3-NC组大鼠表皮干细胞,在整个纪录时间过程中,细胞运行瞬时速度变化波幅大而强烈,说明细胞活跃,运动能力强。Lv-CLC3-sh组大鼠表皮干细胞相比于Lv-CLC3-NC组大鼠表皮干细胞,在整个纪录时间过程中,细胞运行瞬时速度变化波幅小而和缓,波动不明显。说明细胞运动瞬时速度在较低水平,运动能力受到抑制。我们使用IMARIS软件对活细胞工作站(live cell station,LCS)采集数据进行分析,Lv-CLC3-NC组、Lv-CLC3-over expression组、Lv-CLC3-sh组大鼠表皮干细胞6小时迁移运动轨迹长度情况比较。我们可以看到Lv-CLC3-sh组大鼠表皮干细胞迁移运动轨迹长度114.11±10.75相比于Lv-CLC3-NC组大鼠表皮干细胞迁移运动轨迹长度224.43±13.07(P0.01)有显著差异,说明在纪录时间过程中,细胞运行迁移运动轨迹长度降低。进一步说明细胞迁移运动能力受到抑制。Lv-CLC3-over expression组大鼠表皮干细胞迁移运动轨迹长度278.95±29.21相比于Lv-CLC3-NC组大鼠表皮干细胞迁移运动轨迹长度224.43±13.07(P=0.128)无显著差异,说明在纪录时间过程中,Lv-CLC3-over expression组细胞运行迁移运动轨迹长度升高并不明显。结论:正常大鼠表皮干细胞表达CLC-3氯通道蛋白,过表达及抑制CLC-3表达能够改变表皮干细胞因渗透压变化引起的容积敏感性氯电流,起到调节表皮干细胞迁移运动能力作用;在创面修复愈合过程中,创缘表皮CLC-3表达水平增高,提示CLC-3氯通道蛋白在调节表皮干细胞迁移参与创面修复中起重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R641

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