香菇多糖对烧伤脓毒症的免疫调节作用及机制的实验研究

发布时间：2018-06-18 02:30

本文选题：香菇多糖 + 脓毒症　；参考：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：烧伤脓毒症至今仍是临床急危重症病人进入ICU的一个重要原因,并且具有很高的死亡率。烧伤脓毒症对宿主免疫系统的影响是通过多重机制实现的,包括辅助性T细胞稳态失衡,CD4+T淋巴细胞凋亡增加,CD4+CD25+调节性T细胞凋亡减少及细胞因子谱改变等,同时巨噬细胞的功能障碍在脓毒血症等相关炎症反应过程中扮演着重要的角色。香菇多糖是从香菇中提取出的一种能够调节人体免疫及抗癌的药物。研究表明香菇多糖也可以通过强化先天和获得性免疫反应增强宿主的抗感染作用。巨噬细胞和T淋巴细胞是香菇多糖免疫刺激作用的主要效应细胞。然而,关于香菇多糖与脓毒血症的治疗效果及作用机制尚未完全阐明。本研究通过制作小鼠烧伤脓毒症模型,探讨香菇多糖对烧伤脓毒症小鼠的存活时间的影响、相关炎症因子表达、CD4+CD25+调节性T细胞功能变化,进而研究香菇多糖对小鼠巨噬细胞增殖、凋亡、胞饮能力及相关通路的影响。从而阐明小鼠脓毒症发生过程中香菇多糖对其免疫系统的影响及调控机制,从而为改善脓毒症的预后提供更多的分子依据。本课题四部分的具体内容如下:第一部分香菇多糖对烧伤脓毒症小鼠生存率及血清炎性因子影响的研究目的:制备烧伤脓毒症小鼠模型,观察脓毒症小鼠生物学状况的变化、5天生存率、肝脏形态病理学变化,血清中IL-1、IL-10和IFN-γ的变化。方法:将128只雄性BALB/c mice小鼠随机分为烧伤脓毒症组、低浓度(40 mg/kg)、中浓度(100 mg/kg)和高浓度(250 mg/kg)香菇多糖干预组。在注射香菇多糖1、2、3、4天后分别处死小鼠,采集肝脏和血液样本,分离血清。观察脓毒症小鼠生物学状况的变化,HE染色法检测肝脏病理学变化,ELLSA法检测各组小鼠外周血血清中IL-1、IL-10和IFN-γ的变化。另取60只小鼠处理同前,分组方法同前,用于观察各组模型小鼠5天生存率。两组间计量资料采用进行student t分析,多组间比较采用ANOVA,计数资料采用卡方检验,生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线法,检验水准α=0.05。结果:小鼠术后出现感染症状,24 h脓毒症组出现小鼠5天生存率为6.67%,低,中,高浓度香菇多糖注射组小鼠分别在30h,42h,48h出现死亡,5天生存率分别为33.33%、60%和86.67%。烧伤脓毒症小鼠5天生存率与香菇多糖剂量呈正相关(r=0.72)。脓毒症组脓毒症小鼠肝小叶失去正常结构;肝细胞索解离,可见大面积的肝细胞浑浊肿胀,空泡变性,细胞结构破坏;汇管区炎症细胞浸润,可见红细胞积聚。再加入香菇多糖后,脓毒症小鼠的肝小叶结构基本正常;有部分肝细胞变性坏死并伴有少量炎症细胞浸润,高浓度(250 mg/kg)组小鼠肝细胞损伤最小,即香菇多糖剂量越高对脓毒症小鼠肝细胞的损伤越少。低浓度香菇多糖组小鼠外周血中IL-1水平与脓毒症组相比有升高趋势,但差异无统计学意义,中高浓度香菇多糖组小鼠外周血中IL-1水平明显高于脓毒症组小鼠外周血中IL-1水平,差异具有统计学意义。低浓度香菇多糖组小鼠外周血中IL-10水平在各个时间点均低于脓毒症组,差异具有统计学意义(P0.05);中高浓度香菇多糖组小鼠外周血中IL-10水平明显低于脓毒症组,差异具有统计学意义(P0.01)。低浓度香菇多糖组小鼠外周血中IFN-γ水平与脓毒症组相比有升高趋势,但差异无统计学意义(P0.05),中高浓度香菇多糖组小鼠外周血中IFN-γ水平明显高于脓毒症组小鼠外周血中IFN-γ水平,差异具有统计学意义(P0.05)。第二部分香菇多糖对烧伤脓毒症小鼠CD4+T细胞功能影响的研究目的:探讨香菇多糖对CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞功能的影响及对LPS刺激的CD4+CD25+调节性T细胞ERK1/2/Fox O1信号通路表达的影响。方法:应用细胞分离试剂盒分离CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞,应用流式细胞术检测了脓毒症组和香菇多糖干预组小鼠外周血中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞比例,采用ELISA检测脓毒症组和香菇多糖干预组小鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞分泌的IL-10;CD4+T细胞分泌的IL-2,IFN-γ及IL-4水平,MTT法检测CD4+T细胞的活性,实时定量PCR检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞IL-10 m RNA的表达,Western blot检测CD4+CD25+Fox P3+T细胞中磷酸化ERK1/2和磷酸化Fox O1的表达水平,荧光素酶活性实验检测了香菇多糖对Fox O1转录活性的影响。计数资料采用卡方检验,两组间计量资料采用进行student t分析,三组以上比较使用ANOVA分析,检验水准α=0.05。结果:1小鼠在造模后的0到3天,CD4+CD25+Fox P3+T细胞所占CD4~+CD25~+T细胞的比例明显升高,在第3天达到峰值(74.58±8.13%),第4天稍有下降(65.31±6.29%),但是仍然明显高于第一天,差异具有统计学意义(P0.05)。低中高剂量香菇多糖治疗后各个时间段与模型组相比,Fox P3阳性细胞所占比例均显著降低。香菇多糖组小鼠外周血CD4+CD25+T细胞分泌的的IL-10水平较同期模型组小鼠IL-10水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。2香菇多糖处理组的小鼠CD4+T细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平呈现上升趋势,IL-4呈下降趋势。MTT检测CD4+T细胞活性显示,香菇多糖处理组小鼠CD4+T细胞活性增强,且与香菇多糖的浓度相关,差异具有统计学意义(P0.05)。3混合淋巴细胞培养发现来自烫伤合并铜绿假单胞菌感染小鼠的CD·4+CD~25+调节性T细胞能够抑制CD4+T对CD3抗体产生的细胞增殖反应,同时IL-4分泌增加,IFN-γ分泌减少。香菇多糖的加入降低IL-4的分泌,提高了IFN-γ的分泌。4与空白CD4~+CD25~+调节性T细胞相比,加入LPS刺激的CD4~+CD25~+调节性T细胞IL-10 m RNA表达量升高了3.17倍(P0.05),加入40,100,250ng/ml香菇多糖共刺激组的IL-10 m RNA表达水平与单独加入LPS组相比,IL-10 m RNA表达量分别下降了17.84%,48.36%,63.59%(P0.05)。LPS刺激的调节性T细胞加入ERK抑制剂后,与单独LPS刺激的调节性T细胞相比,IL-10 m RNA表达量下降了41.53%(P0.05),LPS刺激的调节性T细胞同时加入ERK抑制剂及香菇多糖后,与单独加入ERK抑制剂相比,IL-10 m RNA表达量没有变化(P0.05)。LPS刺激的调节性T细胞加入p38抑制剂后,与单独LPS刺激的调节性T细胞相比,IL-10 m RNA表达量下降了38.19%(P0.05),LPS刺激的调节性T细胞同时加入p38抑制剂及香菇多糖后,与单独加入p38抑制剂相比,IL-10m RNA表达量下降了43.27%(P0.05)。LPS加入调节性T细胞的不同时间点,p-ERK1/2及p-Fox O1表达显著增高,在15分钟达到最高峰。加入香菇多糖后的各时间点,p ERK1/2和p Fox O1的表达显著下降(P0.05)。LPS刺激的调节性T细胞加入不同剂量(40,100,250ng/ml)香菇多糖后,IL-10启动子荧光素酶活性与单纯LPS刺激的调节性T细胞相比,分别下降了18.31%,47.51%及62.43%。第三部分香菇多糖对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7活性影响的研究目的:探讨香菇多糖对巨噬细胞RAW264.7活性、凋亡、胞饮能力、分泌的NO和TNF-α、及MHC分子表型改变的影响。方法:将RAW264.7细胞在正常条件下培养后,分为三组:PBS组、100 ng/ml LPS组、100 ng/ml香菇多糖和100 ng/ml LPS共培养组。以上三组细胞:MTT检测LPS刺激后24h,48h,72h的细胞活性;流式细胞法检测48h后细胞凋亡比率,MHC I及MHC II分子阳性细胞的比率;Western Blot检测48h后凋亡相关蛋白caspase 3,Bax,Bcl-2的表达;格里斯反应和ELISA方法测定RAW264.7细胞培养液中分泌的NO和TNF-α水平;中性红染料摄取评价24h后RAW264.7细胞的吞饮活动。统计学方法同第二部分。结果:1加入香菇多糖(100 ng/ml)后细胞的活性与LPS相比显著增高,48h细胞的活力达到最高峰,为对照组的81.23%(P0.05),此后72h稍有下降,为对照组的74.59%(P0.05);2 LPS处理组细胞凋亡率为31.0%,加入香菇多糖后,细胞凋亡率下降至24.8%,两组相比差异具有统计学意义(P0.05);3与PBS对照相比,用LPS处理细胞后,促凋亡蛋白(Caspase3和Bax)的表达分别升高了4.62和2.87倍,而抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达降低了63.28%,差异具有统计学意义(P0.05)。而在香菇多糖(100 ng/ml)处理后细胞的促凋亡蛋白(Caspase3和Bax)与LPS相比分别降低了38.39%和52.17%,而抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达升高了1.47倍,差异具有统计学意义(P0.05);4 PBS对照组NO及TNF-α产生量分别为4.67μg/ml及18.25μg,LPS刺激组为22.59μg/ml及89.59μg/ml,香菇多糖显著的降低了NO及TNF-α的水平,为12.21μg/ml,52.49μg/ml,差异具有统计学意义(P0.05);5 50ng/ml香菇多糖对RAW264.7细胞的胞饮能力没有显著影响,100ng/ml香菇多糖能够显著促进RAW264.7细胞的吞饮活动,而且呈剂量依赖性;6正常RAW264.7细胞MHC I,MHC II阳性表达率分别为43.36%及7.28%。香菇多糖处理组增强了MHC II分子表达,阳性表达率为27.64%,与正常RAW264.7组相比差异具有统计学意义(P0.05);香菇多糖处理组MHC I分子阳性表达率为40.65%,与正常RAW264.7组相比无统计学差异(P0.05)。第四部分香菇多糖对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7影响机制的研究目的:探讨香菇多糖对LPS诱导的巨噬细胞的作用机制是否是通过抑制ERK/NF-κB信号通路实现的。方法:应用RT-PCR和Western blot技术检测香菇多糖对i NOS m RNA和蛋白的表达;采用荧光素酶报告基因检测香菇多糖对PBS刺激巨噬细胞组,LPS单独刺激巨噬细胞组,以及香菇多糖与LPS共刺激巨噬细胞组共计三组细胞NF-κB启动子活性的影响;Western blot检测p ERK1/2、p JNK1/2和NF-κB p65的表达。统计学方法同第二部分。结果:1不同浓度香菇多糖,在没有LPS刺激的情况下,i NOS m RNA和蛋白无表达,100ng/ml LPS能显著的诱导巨噬细胞RAW 264.7i NOS m RNA和蛋白的表达。与单纯的LPS相比,加入20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml香菇多糖,i NOS m RNA的表达分别下降了31%,49%和78%,差异有统计学意义(P0.05),i NOS蛋白的表达分别下降了16%,33%和84%,差异有统计学意义(P0.05)。2与PBS对照组相比,LPS单独刺激的巨噬细胞RAW 264.7中荧光素酶活性升高了51.27%,而LPS和香菇多糖共刺激条件下荧光素酶活性与LPS相比,下降了27.28%,差异有统计学意义(P0.05),仍显著高于PBS组,差异有统计学意义(P0.05)。3 p ERK1/2的表达在LPS刺激后的0-6h内的四个时间点逐渐升高。p JNK1/2及核内NF-κB p65表达在LPS刺激后的0.5小时达到高峰,随后逐渐下降。香菇多糖能显著降低各时间点p ERK1/2及p JNK1/2的表达,差异有统计学意义(P0.05)。在LPS刺激后的0.5小时,香菇多糖并不能降低核内NF-κB p65表达,但是在3小时能显著降低核内NF-κB p65表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1香菇多糖通过增强促炎因子IL-1、IFN-γ的表达,降低抗炎因子IL-10的表达,部分恢复烧伤脓毒症小鼠免疫系统的麻痹或瘫痪状态,减少小鼠肝脏损伤,从而增加小鼠的生存率。2香菇多糖可以抑制CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞的ERKFox O1通路,减少IL-10的表达,促进CD4+T细胞的增殖,抑制IL-4表达并促进IL-2和IFN-γ的表达。3香菇多糖可以降低巨噬细胞的凋亡,增强细胞活力、减少NO和TNF-α炎性物质分泌,促进巨噬细胞胞饮能力以及巨噬细胞MHC II分子的表达。4香菇多糖可以抑制i NOS的表达,抑制ERK1/2和JNK1/2的磷酸化,同时抑制NF-κB p65的转录活性和核内表达。综上所述,我们的研究表明香菇多糖可以抑制CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞的ERK-Fox O1通路,来促进CD4+T细胞向Th1细胞极化;同时香菇多糖可抑制巨噬细胞ERK1/2,JNK1/2,NF-κB通路,促进巨噬细胞活化,从而增强免疫细胞功能,改善脓毒症小鼠预后。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R644

【参考文献】