ANGPTL4基因在重症急性胰腺炎肺损伤大鼠肺微血管内皮细胞中的表达和作用

发布时间：2018-06-24 04:48

  本文选题：血管生成素相关蛋白-4（angiopoitin-like + protein4）　； 参考：《大连医科大学》2013年博士论文

【摘要】：目的：重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）具有发病急剧，病情凶险等特点，早期即可出现急性肺损伤（acute lung injury, ALI）并导致死亡。而其确切的发病机制较为复杂，有研究报道以细胞因子和炎症介质的过度释放而引起的肺微血管内皮细胞通透性增加导致的肺水肿是急性肺损伤的主要病理改变。因此，肺微血管内皮细胞的通透性的改变及其机制探讨尤为重要。血管生成素样蛋白4（Angptl4）是一个重要的调节糖代谢、脂代谢和胰岛素敏感性的蛋白,目前被确定为过氧化物体增殖体激活受体γ血管生成素相关蛋白（PPAR-γ）的靶基因。目前的资料显示，Angptl4基因除了参与脂肪脂质代谢外，其在肿瘤方面的作用的研究较多，但关于Angptl4在炎症反应中的作用特别是其在重症急性胰腺炎导致的肺损伤中的作用的研究鲜有报道。 由于SAP诱发ALI的机制复杂，涉及到胰酶激活、过氧化损伤、全身炎症反应、内毒素血症等多个方面，故目前尚未有一种特效的治疗方法，综合治疗方法仍为首选。有研究发现，Angptl4基因在全身炎症反应中可能对集体具有保护性作用。本课题通过观察Angptl4在重症急性胰腺炎大鼠肺组织及肺微血管内皮细胞上的表达变化，以及应用药物干预及转染技术观察其在炎症反应过程中的自身变化及对下游炎症因子的影响。本实验试图从急性胰腺炎肺损伤的动物模型及更直接的向肺微血管内皮细胞中转染Angptl4基因以致其高表达，并应用脂多糖刺激，观察其变化特点，及炎症因子和细胞形态的改变。旨在从更全面的新角度探讨SAP诱发ALI的发病机制，为有效防治急性胰腺炎肺损伤提供新的方法和实验依据。 方法：实验一：健康雄性（Spraghe-Dawley，SD)大鼠32只，体重180g-220g，随机分为4组:假手术组(CON), SAP模型组(SAP)，罗格列酮治疗组(ROSI/ROZ)，GW9662治疗组(GW9662)每组8只。SAP动物模型采用1.5%的去氧胆酸钠溶液(lml/kg)逆行胰胆管注射法。罗格列酮治疗组（剂量:5mg/kg）及GW9662治疗组（剂量5mg/kg）于造模后10分钟立即静脉注射药物一次。假手术组开腹后，仅轻翻动胰腺后关腹。模型建立24h后，各组大鼠麻醉后开腹，取胰腺、肺组织及动静脉采血。观察胰腺和肺组织的病理改变，采用全自动生化分析仪行血气分析，并对血淀粉酶的含量进行测定，双抗体夹心法(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)检测血清TNF-α和RAF-1含量，采用反转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）测定肺组织中Angptl4和PPAR-γmRNA的表达，Western-Blot法测定肺组织中Angptl4和PPAR-γ蛋白的表达。HE染色法观察肺组织及胰腺组织的病理改变，免疫组化法检测肺微血管壁上VEGF的表达和胰腺细胞的BCL-2的表达。 实验二：应用Pricells公司提供的大鼠肺微血管内皮细胞系、经鉴定后，于第三代开始用于实验。培养大鼠肺微血管内皮细胞后将其分为4组：正常组，LPS（100ng/mL）刺激组，LPS+罗格列酮（50g/mL）组，LPS+GW9662（50g/mL）组，药物作用24h后，以Realtime-PCR和Western bloting法检测肺微血管内皮细胞中Angptl4的表达。应用脂多糖LPS（100ng/ml）分别刺激大鼠肺微血管内皮细胞6h,12h,24h,以MTT检测法观察细胞存活情况，并应用罗丹明-鬼笔环肽染色标记细胞骨架F-actin蛋白，观察大鼠肺微血管内皮细胞的形态结构学改变。 实验三：基于实验一与实验二，使用美国Sourcebioscience公司提供的大鼠Angptl4基因为模板，通过重组构建pcDNA3.1-eGFP-Angptl4质粒，用于转染大鼠肺微血管内皮细胞。转染48h后经LPS作用24h，以Realtime-PCR和Westernbloting法检测肺微血管内皮细胞中Angptl4表达变化。培养大鼠肺微血管内皮细胞后将其分为8组：正常组，LPS（100ng/mL）刺激组，LPS+罗格列酮（50g/mL）组，LPS+GW9662（50g/mL）组，pcDNA3.1 eGFP组，pcDNA3.1 Angptl4-eGFP组，LPS+pcDNA3.1-eGFP组，LPS+pcDNA3.1-Angptl4-eGFP组。Western bloting法检测细胞信号通路上的p-MEK1/2, p-AKT/AKT, Bax, casapase8,9蛋白的变化，并ELISA法检测TNF-α含量变化。再次应用罗丹明-鬼笔环肽染色标记细胞骨架F-actin蛋白，观察大鼠肺微血管内皮细胞的形态结构学改变。 结果：1．实验一：与假手术组相比，SAP组血清淀粉酶、TNF-α含量、肺组织中Angptl4mRNA和蛋白表达水平明显增高，而PPAR-γmRNA基因和蛋白的表达却明显降低，胰、肺组织病理损伤明显，具有明显的统计学意义（P0.05）。与SAP组相比罗格列酮药物干预组的胰、肺病理损伤较轻，血清淀粉酶及TNF-α和RAF-1含量降低，肺组织Angptl4和PPAR-γ表达水平明显上升，肺血管内皮细胞上的VEGF和胰腺腺泡上的BCL-2明显受抑制。而GW9662干预组却不同程度降低，具有显著的统计学意义（P0.05）。 2．实验二：CD31抗体鉴别原代大鼠肺微血管内皮细胞。LPS组（100ng/mL）刺激24h后Angptl4蛋白表达增加，而同样应用Angptl4促进剂罗格列酮后，Angptl4蛋白表达增加明显（P0.01）。并且LPS组培养基的TNF-α水平升高。而应用罗格列酮后TNF-α水平下降明显，具有显著差异（P0.01）。而单纯应用LPS刺激后，24h细胞减少达到高峰。罗格列酮组细胞存活率明显高于GW9662组。（P0.01）罗丹明-鬼笔环肽和DAPI分别染色细胞骨架F-actin和细胞核后，激光共聚焦显微镜下观察单纯LPS刺激组，细胞核周围的胞骨架解聚，而罗格列酮应用组的细胞核中央部分解聚明显减少，细胞形态稳定。（P0.05） 3．实验三：pcDNA3.1-eGFP-Angptl4质粒转染48小时后Realtime-PCR和Westernbloting检测肺微血管内皮细胞中Angptl4表达明显比pcDNA3.1-eGFP转染组增加。（P0.01）与实验一、二的结果一致，LPS（100ng/mL）刺激后，肺微血管内皮细胞存活率随时间增加而减少，24h达到高峰（P0.01）转染目的基因后，大鼠肺微血管内皮细胞存活延长。凋亡通路的促凋亡因子Bax蛋白与casapase8,9蛋白在LPS组明显增加，而在应用罗格列酮组与转染目的基因组明显降低（P0.01）。LPS+pcDNA3.1-eGFP-Angptl4组凋亡通路上的调节蛋白p-AKT/AKT和p-mek1/2蛋白明显下调。罗丹明-鬼笔环肽和DAPI分别染色细胞骨架F-actin和细胞核后，激光共聚焦显微镜下观察转染目的组的细胞核中央部分解聚明显减少，细胞形态稳定。（P0.05） 结论：Angptl4是在正常的肺微血管内皮细胞低表达的一种分泌性蛋白，其功能是参与脂质及脂肪的代谢，Angptl4对细胞膜的通透性影响较大，所以其对肺微血管内皮细胞的稳定尤其重要。实验一的结果得出，随着胰腺炎肺损伤的出现、肺水肿的加重，肺组织Angptl4的mRNA表达和蛋白表达水平上调，说明了Angptl4参与了急性炎症反应。而其上游基因PPAR-γ的降低，反应了Angptl4参与的炎症反应并不是直接单靠上游靶基因PPAR-γ的影响。实验二的模仿急性肺损伤的细胞实验结果与动物实验一致，应用罗格列酮药物可以减轻LPS刺激肺微血管内皮细胞导致的肺损伤。实验三进一步应用转染Angptl4基因，观察其对肺微血管内皮细胞的保护作用及在炎症损伤情况下对炎症因子的影响作用。 SAP诱发ALI的发病机制较为复杂，目前研究多认为是由于炎症介质和细胞因子的过度释放，增加了肺微血管内皮细胞的通透性而发生的肺水肿，因此本文选择肺微血管内皮细胞作为靶细胞进行研究。在炎症反应过程中TNF-α是重要的介质之一，它的出现及表达水平高低可被作为SAP预后的标准。而本实验结果SAP组与LPS组血清和培养基中的TNF-α升高，肺水肿加重，炎症反应加重。而罗格列酮的应用Angptl4在肺组织中的表达上调，说明Angptl4的水平与炎症因子TNF-α的变化成反比。同样转染增加了Angptl4的表达后抑制TNF-α的通路上的p-AKT/AKT的表达，减少炎症因子的生成。并且抑制p-mek1/2表达，影响了细胞骨架的F-actin的解聚，抑制细胞收缩，维持细胞形态，减少炎症因子的进一步渗出；抑制促凋亡因子casapase8,9和Bax的生成，拮抗了肺微血管内皮细胞的凋亡。 因此我们推测，Angptl4是炎症反应时的一种正性蛋白，它的增加能干预炎症因子的生成，并且维持肺微血管内皮细胞形态的稳定，对抗炎症反应导致的细胞凋亡，，保护肺功能从而减轻SAP诱发的ALI，为SAP时ALI的防治提供新的的思路和方法。
[Abstract]:Objective : To study the role of Angptl4 gene in the pathogenesis of acute lung injury ( ALI ) .

In this study , it was found that Angptl4 gene might have protective effect on lung tissue and pulmonary microvascular endothelial cells in rats with severe acute pancreatitis , and the changes of inflammatory factors and cellular morphology were observed .

Methods : Thirty - two healthy male Sprague - Dawley ( SD ) rats weighing 180 g - 220g were randomly divided into 4 groups : sham operation group ( CON ) , SAP model group ( SAP ) , roger treatment group ( ROSI / ROZ ) and GW9662 treatment group ( GW9662 ) .

AIM : To observe the expression of Angptl4 in lung microvascular endothelial cells by using lipopolysaccharide ( LPS ) ( 100 ng / ml ) .

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本文编号：2060085