【摘要】：第一部分S1PR2与脓毒症致急性肺损伤发生发展的关系 研究目的： S1P受体2(Sphingosine1-phosphate receptor2,S1PR2)属于七次跨膜G蛋白(G protien)偶联受体家族,与磷脂分子1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate,S1P)结合,启动细胞跨膜信号转导,介导了广泛的生物学效应。近来研究发现,S1P2参与调节内毒素血症中血管内皮炎症反应。而S1PR2在调节宿主防御病原体感染中的作用尚未见报道。因此,本部分研究内容主要检测S1PR2在脓毒症致急性肺损伤发生发展的作用。研究方法： 采用盲肠结扎穿孔(cecum ligation and puncture,CLP)诱导WT(S1pr2+/+)及S1prZ-/-小鼠脓毒症模型,手术后观察小鼠10d生存率；模型后72h琼脂平板培养法检测血液,腹腔灌洗液及肺脏细菌负荷；HE染色观察肺脏形态学改变。采用肺脏定量滴注E. coli,建立WT,S1pr2+/-及S1pr2-/-三种基因型小鼠肺脏直接感染模型,观察模型48h生存率；分别于模型后0h,4h及18h,采用琼脂平板培养法检血液及支气管肺泡灌洗液细菌负荷；HE染色检测肺脏形态学改变；湿干比检测肺水肿；支气管肺泡灌洗液蛋白定量检测肺通透性；ELISA检测血液及支气管肺泡灌洗液炎症因子TNF-a和IL-6水平。分别于E. coli感染模型前后给予WT小鼠S1PR2拮抗剂,观察48h生存率；琼脂平板培养法检测血液及支气管肺泡灌洗液细菌负荷。研究结果： CLP模型后,S1pr2-/-小鼠的10d生存率较WT小鼠显著提高(66.7%：28.6%,*P0.05)；S1pr2-/-小鼠血液,腹腔灌洗液及肺脏细菌负荷较WT小鼠明显降低；S1pr2"/-小鼠肺损伤情况较WT小鼠明显改善。肺脏感染E. coli模型,S1pr2-/-小鼠生存率(80%)较WT(0%)及S1pr2+/-小鼠(0%)显著提高(***P0.001)；模型后,4h及18h,S1pr2-/-小鼠血液及支气管肺泡灌洗液的细菌负荷较WT小鼠均降低5倍以上,肺损伤明显减轻；模型后0h及4h,S1pr2-/-小鼠与WT小鼠肺湿干比及支气管肺泡灌洗液蛋白含量均无显著差异,而18h时,S1pr2-/-小鼠肺湿干比及支气管肺泡灌洗液蛋白含量较WT小鼠均显著降低；模型后0h及18h,S1pr2-/-小鼠与WT小鼠支气管灌洗液TNF-α和IL-6水平无显著差异,而4h时,Slpr2-/-小鼠支气管灌洗液TNF-α和IL-6水平较WT小鼠均显著升高；模型后0h,S1pr2-/-小鼠与WT小鼠血液TNF-α水平无显著差异,而模型后4h到18h,S1pr2-/-小鼠血液TNF-a较WT小鼠持续在较低水平；模型后0h及18h,S1pr2-/-小鼠与WT小鼠血液IL-6水平无显著差异,而模型后4h,S1pr2-/-小鼠血液IL-6水平较WT小鼠显著降低。S1PR2拮抗剂预处理或后处理均可不同程度延长E. coli感染后WT小鼠的生存时间,降低血液及肺脏细菌负荷。 研究结论： S1PR2缺失促进病原体清除,对脓毒症致急性肺损伤有保护作用。 第二部分S1PR2对巨噬细胞吞噬功能的影响 研究目的： 鉴于S1PR2缺失小鼠较WT小鼠在增强肺脏免疫防御能力,降低肺损伤,改善脓毒症小鼠生存率方面表现出极大优势。我们进一步要探讨何种类型免疫细胞S1PR2缺失在此过程中发挥关键作用。研究方法： 构建四种骨髓移植嵌合体模型：WT-WT→WT,S1pr2-/-→S1pr2-/-,WT→S1pr2-/-,和S1pr2-/-→WT,于模型后肺脏滴注E. coli,感染后4h,琼脂平板培养法检测支气管肺泡灌洗液细菌负荷及观察小鼠WT-WT,S1pr2-/-→WT两种嵌合体模型小鼠48h生存率。流式细胞术动态观测E. coli感染肺脏模型后0h,4h及18h,WT及S1pr2-/-小鼠支气管肺泡灌洗液的髓系细胞数量及类型；定量PCR检测原代中性粒细胞及肺泡巨噬细胞E. coli刺激前后S1PR2mRNA水平。建立肺泡巨噬细胞敲除模型,于模型后肺脏滴注E. coli,感染后4h,琼脂平板培养法检测支气管肺泡灌洗液细菌负荷；观察clodronate liposomes→WT及clodronate liposomes→S1pr2-/-两组模型小鼠E. coli感染肺脏后48h存活率。体外检测WT及S1pr2-/-来源肺泡巨噬细胞的吞噬和杀菌功能。 研究结果： 嵌合体模型中,WT小鼠输注S1pr2-/-骨髓细胞后具有S1pr2-/-小鼠的特征,BALF中细胞负荷较WT→WT组显著降低(*P0.05),而S1pr2-/-小鼠输注WT骨髓细胞后,小鼠具有WT小鼠的特征,BALF中细胞负荷较S1pr2-/-→S1pr2-/组显著升高(*P0.05)；,S1pr2-/-→WT组50%小鼠存活时间大于30h,而WT→WT组仅有10%小鼠存活时间超过30h(*P0.05)。肺脏感染E. coli模型后0h及4h时,S1pr2-/-与WT小鼠BALF中的细胞类型以AMs为主,而18h时,S1pr2-/-与WT小鼠AMs数量均急剧下降,取而代之的是中性粒细胞加剧增加,两组无统计；定量PCR分析静息状态及E. coli刺激后2h (E.coli:cell=20:1)后,AMs和中性粒细胞S1PR2的表达水平,发现Ms S1PR2mRNA的水平均约是中性粒细胞的约25倍(***P0.001)。肺泡巨噬细胞敲除模型后肺脏感染E. coli,发现control liposomes处理组,WT小鼠与S1pr2-/-小鼠支气管肺泡灌洗液中细菌负荷存在显著差异(*P0.05),而采用clodronate liposomes敲除肺泡巨噬细胞后,S1pr2-/-小鼠肺脏细菌清除优势消失,与WT组支气管肺泡灌洗液细菌负荷无统计学差异；肺泡巨噬细胞敲除后S1pr2-/-小鼠的保护作用消失,与WT比较,生存时间无统计学差异。体外吞噬杀菌实验,S1pr2-/-肺泡巨噬细胞吞噬未经调理素处理的荧光E. coli的能力较WT肺泡巨噬细胞显著增强(荧光强度,S1pr2+/+,407.8±71.6; S1pr2-/-,2035.2±202.1,***P0.001);调理素处理过的荧光E. coli可以显著增强WT肺泡巨噬细胞的吞噬能力(增加约3倍),而对S1pr2-/-肺泡巨噬细胞吞噬能力无明显提高；S1PR2对肺泡巨噬细胞杀菌功能无影响。调理素处理可以改善WT小鼠生存时间,对S1pr2-/-小鼠生存时间无影响。 研究结论： 肺泡巨噬细胞S1PR2缺失可增强非调理素依赖的E. coli的吞噬能力,增强肺脏免疫防御能力,减轻肺损伤。 第三部分S1PR2抑制巨噬细胞吞噬的分子机制 研究目的： 综合第一部分和第二部分的研究,S1PR2缺失可增强巨噬细胞吞噬功能,提高肺脏免疫防御能力,减轻肺损伤。本部分通过模拟在体肺损伤发展不同阶段微环境,探讨S1PR2配体浓度差异影响巨噬细胞吞噬的分子机制。 研究方法： E. coli感染肺脏模型后0h,4h及18h收集支气管肺泡灌洗液,同时体外应用E. coli刺激骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)并收集刺激后0min,30min及90min的细胞上清液,高效液相联合质谱(HPLC-ESI-MS/MS)检测S1P浓度。体外观察不同浓度S1P活化S1PR2对Texas Red标记的E. coli吞噬能力的影响；模拟肺损伤晚期高浓度SIP (100nM)环境,激光共聚焦检测高浓度S1P对WT及S1pr2-/-BMDMs骨架形态的影响；及在此条件下激光共聚焦比较WT及Slpr2-/-BMDMs对吞噬能力；Pull down检测WT及S1pr2-/-BMDMs不同体外模型中RhoA-GTP水平。体外单纯E. coli刺激BMDMs模拟肺损伤早期S1P环境,免疫荧光标记Rac1,激光共聚焦检测WT及S1pr2-/-BMDMs在E. coli刺激前后细胞分布；Pull down检测WT及S1pr2-/-BMDMs E. coli刺激前后Racl-GTP水平；检测WT及S1pr2-/-BMDMs E. coli刺激前后胞膜F-actin含量；免疫共沉淀检测WT及S1pr2-/-BMDMs E. coli刺激前后,IQGAP1磷酸化水平及与Rac1偶联水平；siRNA干扰WT及S1pr2-/-BMDMs IQGAP1表达,pull down检测其对Racl-GTP水平,荧光显微镜观察其对Texas Red标记的E. coli吞噬能力的影响。 研究结果： HPLC-ESI-MS/MS检测体内肺脏E. coli模型后0h及4h,支气管肺泡灌洗液S1P浓度均小于10nM,而18h时,S1P浓度急剧增加至100nM以上,且WT或Slpr2-/-小鼠差别不大；同时,体外研究发现,E. coli刺激BMDMs(0min,30min及90min),培养基上清中S1P浓度上升有限,均小于10nM。观察不同浓度S1P活化S1PR2对Texas Red标记的E. coli吞噬能力的影响,发现单纯E. coli刺激(模拟肺损伤早期4h点,肺内低S1P环境),S1pr2-/-BMDMs吞噬能力(FI值)约为WTBMDMs的1.5倍(**P0.01)；给予外源性S1P(100nM及以上,模拟肺损伤模型后18h点的高S1P环境),可显著降低WT BMDMs的吞噬能力约40%(***P0.001),而不影响S1pr2-/-BMDMs吞噬能力。激光共聚焦观察不同吞噬环境下细胞骨架蛋白的变化,发现由单纯E. coli刺激,BMDMs自分泌产生的S1P不足以使WT及S1pr2-/-BMDMs发生细胞骨架收缩,但是E. coli刺激诱发WT BMDMs伸出板状伪足的数量明显少于S1pr2-/-BMDMs,同时WTBMDMs吞噬的红色荧光E. coli数量较S1pr2-/-BMDMs少；外源性给予高浓度S1P(100nM),WT BMDMs骨架全部收缩,且E. coli刺激不可诱发板状伪足形成,红色荧光E. coli数量较少,相反,S1P对S1pr2-/-BMDMs对E.coli的反应性无影响,仍可见较多板状伪足形成,吞噬的红色荧光E. coli数量较多。静息状态下及单纯E. coli刺激RhoA-GTP水平在WT及S1pr2-/-BMDMs中均很低；外源性给予100nM S1P可显著上调WT BMDMs中RhoA-GTP水平,而对S1pr2-/-BMDMs无明显影响(*P0.05)。激光共聚焦成像观察,静息状态下Racl集中分布在核周,E. coli刺激30min后,可见S1pr2-/-MDMs中绝大多数Racl迅速富集到细胞膜周边,而WTBMDMs中Rac1仅有少量向膜转移,绝大多数仍分布于胞浆；Pulldown检测Rael-GTP活性,发现静息状态下,WT BMDMs及S1pr2-/-BMDMs中Racl-GTP基本检测不到,E. coli刺激30min后,S1pr2-/-BMDMs中Racl-GTP水平较WT BMDMs显著升高(*P0.05)；Western blot发现,细菌孵育后,WTBMDMs F-actin的含量明显少于S1pr2-/-BMDMs(**P.01);细胞免疫荧光及免疫共沉淀检测,发现IQGAP1与Rac1存在共定位,siRNA感染IQGAP1后S1pr2-/-BMDMs中Rac1-GTP水平降低,吞噬能力减弱。研究结论： S1PR2信号通路抑制巨噬细胞吞噬的分子机制依赖于其配体S1P浓度：高浓度S1P激活S1PR2促进RhoA活化,致细胞收缩变圆；低浓度S1P活化S1PR2抑制IQGAP1-Rac1通路,抑制板状伪足形成。上述两种机制分别反映了在肺损伤晚期及早期,S1PR2活化抑制巨噬细胞吞噬的分子机制。 第四部分外周血单核细胞S1PR2表达与脓毒症患者预后分析 研究目的： 综合前三部分的研究结果,表明巨噬细胞S1PR2缺失后吞噬病原菌能力增强,从而对脓毒症具有保护作用。为了深入探讨以S1PR2为靶标进行干预的临床应用价值,我们进一步检测了ICU脓毒症患者及对照患者外周血单核巨噬细胞S1PR2的表达水平与预后的关系。 研究方法： 严格按照脓毒症诊断标准,收集2013年8月-2015年1月期间入住浙江大学医学院附属第一医院ICU的脓毒症患者28例及对照10例,在入住ICU24h内采集患者外周血标本6ml排除化疗、AIDS、激素治疗和器官移植等患者。所有患者在入住ICU24小时内进行APACHE Ⅱ (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ)评分及SOFA (Sequential Organ Failure Assessment)评分,并作为反应脓毒症预后指标。采用Ficoll法分离外周血单核细胞(PBMCs),定量PCR检测S1PR2mRNA水平。荧光显微镜观察不同患者来源及S1PR2mRNA表达水平的PBMC对Texas Red标记的E. coli (E. coli: AMs=20:1)的吞噬能力。 研究结果： 定量PCR检测数据显示,脓毒症患者S1PR2表达水平较对照组显著升高(*P0.05)；相关性分析表明脓毒症患者S1PR2表达水平与APACHE Ⅱ评分正相关,即S1PR2表达水平增加,APACHE Ⅱ评分也增加(-=0.845); PBMCs吞噬功能检测发现,对照患者S1PR2表水平最低,吞噬能力最强,相反,脓毒症患者随着S1PR2表达水平的不同程度升高,其PBMCs的吞噬能力呈现不同水平的降低, 研究结论： 外周血单核细胞S1PR2表达水平升高与脓毒症不良预后存在相关性,以S1PR2为靶标进行干预可能是脓毒症治疗的新方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7
【共引文献】
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本文编号：
2150544
