UCP2在脓毒症大鼠心肌细胞线粒体中的作用及初步机制探讨

发布时间：2018-09-03 07:50

【摘要】：研究背景脓毒症(sepsis)是由感染诱发的机体调节失衡所致的危及生命的器官功能不全。其高发病率和高死亡率耗费了大量的医疗资源。据统计,美国每年严重脓毒症患者的新发病例约为750,000,并且以每年1.5%的速度增长,到2020年,每年将增加上百万的脓毒症患者。脓毒症的发病机制很复杂,其主要的病理生理可以概括为：细胞因子及细胞炎症介质过多释放、肠道细菌的移位及由此导致的内毒素血症、凝血功能紊乱与炎症系统的相互作用、以及微循环衰竭和线粒体功能损害等。近年来,脓毒症导致的线粒体功能不全成为研究热点。有研究发现,脓毒症时心功能障碍的发生率高达40%。入住ICU的脓毒症患者,存在心肌抑制因素的患者与比没有心肌抑制因素的相比,第一个24小时需要更多的液体进行复苏,而且死亡率更高。一系列体内及体外的研究发现,脓毒症心肌损害与脓毒症的恶化密切相关。心脏富含线粒体,脓毒症中线粒体的功能障碍越来越被学者关注。以前的研究显示,很多因素与脓毒症心肌损害的发生有关,如ROS的过多产生,ATP能量合成的不足,以及线粒体膜电位的破坏等因素。目前,关于脓毒症患者发生心肌功能损害的具体机制仍然不是很清楚。这可能与微循环改变、心肌细胞线粒体功能障碍、细胞凋亡、炎症通路损伤、氧化应激等因素相关。而线粒体作为脓毒症损伤的一个重要靶点,其在心肌损伤过程中的作用,越来越受到重视。线粒体膜质子转运蛋白——解偶联蛋白(uncoupling proteins, UCPs)存在于所有的哺乳动物中,属于线粒体阴离子通道(nion channels)家族,UCPs基因有高度的保守性,有6个家族成员,在人仅表达UCP1-5。UCP3基因位于11q13,与UCP2紧密连锁,相隔仅6000bp,其氨基酸序列与UCP1和UCP2的同源性高达57%和73%,广泛表达与各组织细胞。化学渗透假说(chemiosmotic hypothesis)认为,氧化磷酸化偶联的基本原理是：电子传递中的自由能差造成H+穿膜传递,暂时转变成电化学质子梯度,这种势能又驱使H+回流,并释放能量,驱动结合在内膜上的ATP合成酶,催化ADP磷酸化合成ATP。然而,在某些生理或病理条件下,H+不通过ATP合成酶而是通过其他通道也可以从线粒体内膜渗漏到线粒体基质中,但此过程不产生ATP。后来这种解偶联作用被证实是由线粒体内膜上的运载体UCPs所介导的。目前有关UCP的研究主要集中于代谢紊乱时糖、脂及氧化应激代谢调控。不论在体内还是体外,UCP2的上调可以通过调控膜电位、线粒体ROS及ATP合成进而保护神经元细胞,而UCP2敲除则会导致线粒体ROS产生明显增多。此外,UCP2还参与调控各种生理及病理过程,如食物的摄入量、代谢性疾病及动脉粥样斑块的形成等。当线粒体内膜电势升高时,UCP2可降低△μH+,从而抑制ROS的产生。Derdak等研究发现解耦联蛋白2(UCP-2)可抑制NF-kB的产生,进而降低ROS生成,从而抑制氧化应激对心肌细胞的损伤。然而,UCP2在脓毒症心肌细胞中的作用仍然不明确。UCP2是否可以通过调控线粒体膜电位抑制ROS的合成进而保护心肌细胞尚需要更进一步的研究。我们假设在脓毒症下UCP2通过调控膜电位进而保护心肌细胞。本研究在构建UCP2过表达的稳转株心肌细胞和RNAi抑制UCP2的基础上,用Lps/PepG刺激,检测线粒体形态与功能的相关指标,揭示UCP2在脓毒症心肌细胞中的保护作用机制。研究目的及意义本课题在构建UCP2过表达及RNAi沉默UCP2的稳转株心肌细胞基础上,用脂多糖及肽聚糖混合制剂刺激细胞,通过检测心肌细胞线粒体的形态,线粒体肿胀度、线粒体膜电位、线粒体ROS及氧化应激指标、线粒体ATP含量、线粒体mtDNA等指标,揭示UCP2在脓毒症心肌细胞线粒体中的保护作用及机制,为临床治疗脓毒症时心肌损伤提供基础理论支持。研究方法1、实验分组①RNA干扰筛选实验分组：筛选有效的UCP2干扰基因片段。将H9C2心肌细胞随机分成五组,分别为：①Control组,给予等量的生理盐水；②Lipofectam ine组,给予等量的Lipofectamine 2000;③siRNAl组,给予siRNAl干扰序列；④siRNA2组,给予siRNA2干扰序列；⑤ncRNA组,给予ncRNA序列。上述各siRNA的终浓度为80nmol/1。②干扰实验分组：将H9C2心肌细胞随机分成四组,分别为：①Control组,给予生理盐水刺激；②LPS/PepG组,给予LPS及PepG刺激；③LPS/PepG+siRNA组,给予LPS及PepG刺激后予siRNA干预；④LPS/PepG+ncRNA组,给予LPS及PepG刺激后予ncRNA干预。上述LPS的终浓度为2 μg/ml, PepG的终浓度为20μg/ml。③过表达细胞分组：将H9C2心肌细胞随机分成四组,分别为：①Control组,给予生理盐水刺激；②LPS/PepG组,给予LPS及PepG刺激；③PHBLV组,空病毒载体转染H9C2细胞,然后给予LPS及PepG刺激；④PHBLV-UCP2组,然后给予LPS及PepG刺激UCP2过表达H9C2细胞。上述LPS的终浓度为2μg/ml, PepG的终浓度为20 μg/ml。2、RNA干扰实验①结合文献及前期实验结果,按照RNA干扰片段设计方法,设计2条RNA干扰片段,先进行预实验,确定有效的siRNA;然后以此siRNA作为干扰片段,进行RNA干扰实验；②将siRNA转染心肌细胞,然后观察其在脓毒症条件下,对线粒体形态及功能的影响。3、UCP2过表达慢病毒载体的构建及稳定心肌细胞株的筛选①提取大鼠总的RNA,反转录得到cDNA,调取UCP2目的基因并进行PCR扩增,电泳回收目的基因。pMD19-T载体(克隆载体)与UCP2目的基因的连接,然后转染新鲜的大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆并测序。②从UCP2重构的T质粒中扩增目的基因, 然后与慢病毒穿梭载体pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro进行连接；然后将连接产物进行转化及扩增、并测序。③慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,过滤并超离心浓缩病毒,并进行浓度滴定。④慢病毒感染稳定细胞系,慢病毒感染心肌细胞后,用嘌呤霉素进行筛选,直至筛选完全。因载体能合成抗筛选药物的蛋白而得以存活,以空载的细胞为阴性对照实验。经PCR及WB验证,证实UCP2过表达H9C2细胞株建立成功,可进行下一步实验。4、脓毒症心肌细胞模型指标：CK及LDH, IL-6及TNF-a水平①比色法检测肌酸激酶：用多功能酶标仪,按照南京建成的检测肌酸激酶测试盒说明书,进行操作。②比色法检测乳酸脱氢酶：用多功能酶标仪,按照南京建成的检测乳酸脱氢酶(LDH)测试盒说明书进行操作。③ ELISA法检测IL-6水平：根据试剂盒说明进行操作。试剂盒为：Rat Interleukin 6 (IL-6) ELISA Kit? Cusabio Life Science, Wuhan, China.④ ELISA法检测TNF-a水平：根据试剂盒说明进行操作。试剂盒为：Rat TNF-a ELISA Kit, Cusabio Life Science, Wuhan, China。5、线粒体形态分析：电镜观察线粒体形态学变化,流式细胞仪检测线粒体肿胀度①电镜观察标本制备：培养并收集心肌细胞,先用3%戊二醇固定,再予1%饿酸后固定,用酒精脱水,然后置换、包埋、浸透、包埋。电镜修块,在AO超薄切片机下切1μM的半薄切片,饱和醋酸双氧铀染后电镜下观察。②线粒体肿胀度检测：采用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)常规的绿色荧光(FITC-H)和红色荧光(PI-H)进行检测,以红色荧光强度／绿色荧光强度计算膜电位,比值可间接反映线粒体膜电位变化。以前向角散射(forward scatter, FSC)和侧向角散(sidescatter, SSC)平均荧光强度的比值(FSC/SSC)反应线粒体肿胀度。6、激光共聚焦显微镜定性观察线粒体膜电位与流式细胞仪定量分析膜电位①激光共聚焦显微镜定性观察线粒体膜电位：采用JC-1染色,原理与流式细胞仪检测一致。在6孔培养板上H9C2心肌细胞用JC-1进行荧光染色,然后在激光共聚焦显微镜下观察,红色荧光与绿色荧光的比例代表了线粒体膜电位。②流式细胞仪定量分析线粒体膜电位：采用一种阳离子脂质荧光染JC-1作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1有单体和多聚体两种存在状态,在低浓度时以单体的形式存在,高浓度时以多聚体形式存在,两者的发射光谱不同。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位升高时,JC-1聚合体形式增加,FL-2/FL-1比值升高；线粒体膜电位下降时,JC-1单体形式增加,FL-2/FL-1比值降低。7、Real-time RT-PCR及Western Blot检测UCP2在基因水平及蛋白水平的表达①WB使用线粒体提取试剂盒提取大鼠心肌组织线粒体蛋白,用BCA法测蛋白浓度。以β-actin蛋白作为内参。通过ECL显影。Gel-Pro analyzer 4.0软件比较各条带的灰度值,分析各蛋白在表达水平变化。②T-PCR检测使用Takara公司试剂盒及PCR仪进行RNA提取、逆转录及PCR反应。ABI7500荧光定量PCR仪上样,按照扩增标准程序进行。每个样本设置3个复孔,计时取平均值,18sRNA作为内参基因,使用2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。8、线粒体氧化应激损伤相关检测：MDA、SOD、GSH等的检测。氧化应激因子检测按照SOD、MDA、GSH检测试剂盒说明书进行。通过考马斯亮蓝法检测线粒体蛋白浓度,按照说明书要求将线粒体蛋白加入反应液后反应,酶标仪上设置不同的检测波长读出OD值,根据公式计算出酶活性或浓度。9、线粒体功能检测：线粒体ATP含量检测,线粒体ROS检测,线粒体mtDNA检测。①线粒体ROS检测：荧光探针DCFH-DA没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。②线粒体ATP含量检测：按照说明进行分光光度计检测。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下,ATP水平会下降,而高葡萄糖刺激等对于一些细胞可以上调细胞内ATP水平。具体操作过程按照试剂盒说明书进行。③线粒体mtDNA检测：设计cytb引物,然后提取线粒体总的DNA,然后以该总的DNA为模板,进行荧光定量PCR,检测cytb的拷贝数反映线粒体mtDNA的水平。10、统计方法所有数据采用IBM SPSS 18统计软件进行统计描述及统计推断。计量资料以均数±标准差(x±s)表示。计量资料符合正态分布且方差齐时,则采用多样本间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA);若各组间差异有统计学意义,方差齐者进一步使用LSD检验进行多样本均数两两比较,方差不齐者使用Welch校正后再使用Games-Howell法比较。P0.05表示差异有统计学意义。结果1、脓毒症细胞模型成功建立：我们用来自金黄色葡萄球菌细胞壁上的PepG与来自革兰阴性菌LPS组成混合剂,刺激H9C2心肌细胞后,检测到Lps/PepG组细胞培养液中的CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平明显高于Control组。Control组线粒体边界清楚,基质均匀,线粒体嵴致密,形态大致正常。Lps/PepG组线粒体边界模糊不清,体积明显肿胀,基质密度降低,部分线粒体内膜破裂、嵴疏松溶解,甚至嵴断裂现象,可见空泡样变。这提示脓毒症的细胞模型构建成功。2、RNA干扰片段筛选结果：与Control组相比,SiRNA1组和SiRNA2组UCP2-mRNA基因拷贝数明显降低,分别下降了59%和69%,差异有统计学意义,故选择SiRNA2干扰片段作为后续UCP2基因干扰实验。3、UCP2基因的表达结果：①干扰实验显示：Lps/PepG+siRNA组的UCP2蛋白相对密度值和UCP2 mRNA表达相对拷贝数均明显低于Control组及Lps/PepG组；②过表达实验显示：PHBLV-UCP2组的UCP2蛋白相对密度值及UCP2-mRNA相对拷贝数均明显高于Control组及Lps/PepG组。这说明干扰实验及过表达实验基因构建是成功的。4、UCP2沉默及过表达对CK、LDH、及IL-6、TNF-α的水平影响：①干扰实验显示：Lps/PepG+siRNA组的CK水平及LDH水平明显高于Lps/PepG组;Lps/PepG+siRNA组的TNF-a水平及IL-6水平均明显高于Lps/PepG组,这提示干扰UCP2导致脓毒症细胞损伤及炎症因子释放进一步加重。②过表达实验显示:PHBLV-UCP2组的的CK水平和LDH水平均明显低于Control组及Lps/PepG组;PHBLV-UCP2组的IL-6水平和TNF-a水平均明显低于Lps/PepG组,这提示UCP2过表达抑制脓毒症细胞损伤及炎症因子的进一步释放。5、线粒体肿胀度：①干扰实验显示：与Lps/PepG组相比,Lps/PepG+siRNA组FSC/SSC值明显升高,且线粒体形态损坏更加明显,表现为线粒体肿胀明显,基质密度降低显著,可见内膜破裂及嵴断裂,空泡样变更加明显；这提示干扰UCP2导致脓毒症线粒体损伤加重。②过表达实验显示：与Lps/PepG组相比,PHBLV-UCP2组的FSC/SSC值明显将低,线粒体形态损坏有所改善,表现为线粒体肿胀减轻,基质密度增高,内膜破裂及嵴断裂减少,空泡样变不明显；这提示UCP2过表达有利于保护脓毒症线粒体。6、线粒体膜电位：①干扰实验显示：与Lps/PepG组相比,Lps/PepG+siRNA组的红色荧光／绿色荧光比值明显增高, MMP明显增高；②过表达实验显示：与Lps/PepG组相比,PHBLV-UCP2组的红色荧光／绿色荧光比值明显上升,MMP明显增高；但PHBLV-UCP2组MMP的幅度没有Lps/PepG+siRNA组高。这提示：UCP2可以调控膜电位水平,但具体调控程度尚不明确。7、线粒体ROS及其他氧化应激指标：①干扰实验：与Lps/PepG组相比,Lps/PepG+siRNA组的ROS及MDA含量明显高于Lps/PepG组,SOD及GSH明显降低；提示干扰UCP2导致脓毒症线粒体氧化应激损害加重。②过表达实验：与Lps/PepG组相比,PHBLV-UCP2组的ROS及MDA含量明显降低,SOD及GSH明显升高；这提示UCP2过表达可以抑制脓毒症线粒体氧化应激损害。8、线粒体ATP含量及mtDNA拷贝数：①干扰实验：与Lps/PepG组相比,Lps/PepG+siRNA组的mtDNA拷贝数明显降低,而ATP含量无明显差别；提示干扰UCP2导致脓毒症线粒体生物修复功能进一步受到损害。②过表达实验显示：与Lps/PepG组相比,PHBLV-UCP2组的mtDNA拷贝数及ATP含量均明显增高;这提示UCP2过表达可以保护脓毒症线粒体能量合成及生物修复功能。结论：UCP2在脓毒症大鼠心肌细胞线粒体损伤中起着保护作用,其机制可能是：UCP2通过解耦联作用调控线粒体膜电位,进而改变线粒体ROS合成的量及速度,维持线粒体ATP的合成及线粒体的生物修复功能,最终起到保护线粒体形态结构及功能的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7

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