烟雾吸入性损伤大鼠肺组织TLR2和TLR4表达的研究

发布时间：2018-10-08 10:46

【摘要】：目的从基因和蛋白水平检测烟雾吸入性损伤后大鼠肺组织Toll样受体的表达水平的变化，以及肺泡灌洗液中IL-6和TNF的表达水平，探讨Toll样受体及下游炎症因子在烟雾吸入性损伤后肺组织中的表达和作用。 方法将30只雌雄各半，体重在200g-250g的SD大鼠按照随机数字表法分为A、B、C、D、E共5组，每组6只，，A组为空白对照组，B组、C组、D组和E组分别为烟雾吸入后0.5h、2h、4h和6h组。使用自制的烟雾发生器加热木屑和煤油的混合物，将大鼠放入致伤室，致伤5min后取出，置于无烟雾的通风处5min，再次致伤，共致伤3次，每次5min，致伤完毕后，按照各组时间点用水合氯醛麻醉，解剖大鼠胸腔，采取心脏血、肺泡灌洗液和肺组织。通过以下方法进行实验：1.通过肺组织大体标本观察比较吸入性损伤后肺的大体变化；2.通过肺组织干湿比（W/D）测定不同时间点各组大鼠肺组织的水肿程度；3.通过聚合酶链式反应（PCR）检测肺组织匀浆中TLR2和TLR4的mRNA表达水平；4.用免疫印迹（Western blot，WB）检测TLR2和TLR4蛋白表达水平；5.经酶联免疫吸附试验（ELISA）测定炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平；6.通过HE染色，在光学显微镜下观察肺组织结构和形态变化；7.用免疫组织化学方法检测TLR2和TLR4蛋白表达水平。通过相应的图像分析及统计方法进行结果分析，比较烟雾吸入性损伤后肺组织的大体和组织学变化，肺组织TLR2和TLR4在mRNA和蛋白水平的表达水平，以及炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平。 结果（1）.大体观察烟雾吸入伤后肺体积较正常肺体积略增大，肺表面胸膜下可见大量散在的斑片状出血，气管和支气管内有粘液及泡沫状分泌物，粘膜充血肿胀，剖开肺脏见肺组织充血、肿胀，双肺可见弥漫性出血点和泡沫状液体渗出。（2）.肺组织标本经烘干后用天平称重，计算W/D值，结果显示烟雾吸入后各时间点肺组织W/D值均高于对照组（P0.05）。其中伤后2h组最高，为5.225±0.263。而伤后各组之间W/D值则无显著性差异（P0.05）。（3）.经PCR检测烟雾吸入后肺组织TLR2和TLR4mRNA表达水平，结果提示烟雾吸入后TLR2在各时间点mRNA水平均高于对照组（P0.05），其中在烟雾吸入后4h肺组织TLR2水平最高，高于烟雾吸入后其他各时间点（P0.05），说明TLR2mRNA水平在烟雾吸入后4h达高峰，在烟雾吸入6h时开始下降。而伤后0.5h组、2h组和6h组相比差异无统计学意义（P0.05）。TLR4mRNA的变化趋势为持续升高，各实验组均高于对照组（P0.05），其中伤后2h组、4h组和6h组之间差别无统计学意义（P0.05），但都较伤后0.5h组明显升高（P0.05）。（4）.免疫印迹法检测TLR2和TLR4蛋白表达水平与PCR结果基本相符，烟雾吸入后各组TLR2表达水平均明显高于对照组（P0.05），烟雾吸入后2h、4h和6h组TLR2蛋白表达水平比0.5h组高（P0.05），其中烟雾吸入后4h组最高，为37.52±3.29ng/ml，但与2h、6h组相比差异无统计学意义（P0.05）。烟雾吸入后各组TLR4蛋白表达水平均明显高于对照组（P0.05），烟雾吸入后6h组TLR4蛋白表达水平最高，为37.20±3.58ng/ml，与其他各组相比均有显著性差异（P0.05）。（5）.经酶联免疫吸附法测定肺泡灌洗液中的炎症因子IL-6和TNF-α。烟雾吸入性损伤后各时间点肺泡灌洗液中IL-6水平均高于对照组（P0.05）；0.5h组与对照组相比无统计学差异（P0.05），其中烟雾吸入后4h组IL-6表达最高，与对照组和0.5h组相比差异具有统计学意义（P0.05）。TNF-α在烟雾吸入后持续升高，烟雾吸入后各时间点TNF-α的表达均高于对照组（P0.05）。0.5h、2h和4h组TNF-α表达水平无明显差异（P0.05），6h组TNF-α表达水平最高，为6.2±1.4ng/mg，与其他各组差异有统计学意义（P0.05）。（6）.肺组织HE染色光镜下显示0.5h,2h,4h和6h组的肺组织均出现不同程度的炎性浸润、水肿。其中0.5h组的炎性损伤最轻，4h和6h组的表现较2h组更明显。（7）.免疫组织化学检测发现TLR2和TLR4在五个组中均有阳性表达，伤后各组随时间持续升高，整体趋势与PCR和WB结果基本相符。染色发现TLR2和TLR4在细胞表面和胞浆都有表达。 结论1.烟雾吸入性损伤后大鼠肺组织TLR2和TLR4在mRNA和蛋白水平的表达上调并参与炎症反应。2.烟雾吸入性损伤后大鼠肺组织的炎症反应随时间逐渐加重，炎症因子IL-6和TNF-α的表达在伤后早期逐渐升高，与肺组织损伤有相关性。3. TLR2和TLR4在烟雾吸入性损伤后的表达水平与炎性因子IL-6和TNF-α的表达趋势相符，提示烟雾吸入性损伤的炎症反应有Toll样受体的信号通路的参与。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R644

【参考文献】

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本文编号：2256474