细胞损伤早期线粒体裂解的时间曲线及环孢素A对线粒体膜稳定作用的初步探讨

发布时间：2018-10-21 08:12

【摘要】：目的创伤导致机体出现全身炎症反应综合征，甚至发生多器官功能衰竭。全身炎症反应综合征的发病机制及防治至今仍未完全了解。现已有许多实验研究证实当机体损伤时，组织细胞破裂，线粒体释放入循环系统，待线粒体裂解后，大规模激发炎症反应，继而发生SIRS，甚至引发MODS。由于线粒体是一种稳定的膜细胞器，它在机体损伤后，多长时间会由细胞内释放出来，，多长时间会裂解，现在还都不清楚。本实验将试图揭示细胞损伤早期线粒体释放入血后的裂解时间曲线，同时观察细胞膜保护药物环孢霉素A对线粒体膜稳定作用的效果。方法本研究在细胞水平、分子水平，探索线粒体膜结构的稳定性，以及抑制线粒体膜裂解的方法，作为一种源头性抑制损伤相关分子模式启动失控性SIRS的机制，从分子、细胞展开研究，阐明细胞损伤后线粒体释放入血，其膜破裂的时间变化曲线及其抑制因素。并将线粒体作为一种预警机制引入损伤控制外科学，探索机体严重创伤后SIRS防治新靶点。 第一部分：取6g新鲜大鼠肝脏组织，分别用蔗糖法和试剂盒法提取3g大鼠肝脏组织中的线粒体，从线粒体提取纯度来评价线粒体提取质量，探索适合于我们线粒体实验研究的大鼠肝脏细胞线粒体的提取方法，同时也为线粒体提取质量的评价提供实验依据。 第二部分：将新鲜大鼠线粒体从大鼠肝脏中提取出来，利用MAO的浓度表示线粒体的浓度，将MAO浓度为200U/ml的线粒体悬液5ml置于20ml大鼠血清中培养，12小时内在不同时间点（每半小时一次）测定培养基中MAO、COX及MDH的含量。观察线粒体膜和基质中各自特异性酶的含量时间变化曲线，分析线粒体膜裂解高峰出现的时间。 第三部分：再次从大鼠肝脏中将新鲜大鼠线粒体提取出来，将MAO浓度为200U/ml的线粒体悬液5ml置于20ml大鼠血清中培养，同时加用1ml100mg/ml的环孢霉素A药物对线粒体膜进行保护，仍在12小时内不同时间点（每半小时一次）测定培养基中线粒体内膜和基质中各自特异性酶COX及MDH的浓度。设置对照组，加入1ml生理盐水。同时测定两组的浓度时间变化曲线，统计学分析，观察该药物对线粒体膜破裂是否有明确抑制作用。 结果 1、试剂盒法和蔗糖法分别提取的线粒体琥珀酸脱氢酶和酸性磷酸酶的纯化倍数没有统计学差异（P0.05)，但蔗糖法提取的线粒体碱性磷酸酶的纯化倍数大于试剂盒法，差异有统计学意义(P0.05)。即使用组织线粒体分离试剂盒提取的线粒体的细胞膜污染较使用蔗糖法提取的小，更适合用于今后实验所需要的提取线粒体步骤中。 2、线粒体离体培养时COX和MDH的浓度分别在3小时、3.5小时到达峰值。实验结果表明培养液中MAO的浓度随着时间的变化没有明显改变，但COX和MDH的含量会随着时间的延长逐渐增加，到达波峰，再平缓下降。由此可知完整线粒体由细胞中释放出来后大约3.5小时达到裂解的峰值。 3、对照组中COX、MDH峰值出现于3小时、3.5小时，峰值分别为1.384U/l，34.568U/l；实验组中COX、MDH峰值出现于6小时、6.5小时，峰值分别为1.376U/l，31.994U/l。2组数据各个时间点分别进行统计学分析，3小时时，对照组中COX浓度显著高于实验组（P0.05）；3.5小时时，对照组中MDH浓度显著也显著高于实验组（P0.05）。由此可知，加入环孢霉素A药物作用线粒体后，线粒体膜裂解时间显著推迟，并且峰值数值均稍降低。 结论 机体损伤后细胞破裂，完整线粒体释放入血，经过3.5小时达到其裂解峰值，加用环孢霉素A药物可以显著延迟线粒体的裂解，并降低其峰值水平。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R459.7

【共引文献】

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本文编号：2284504