载脂蛋白E对创伤性颅脑损伤后内质网应激的影响及意义

发布时间：2018-10-25 07:31

【摘要】：创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）后以细胞凋亡为主要特征的继发性脑损害是影响病情转归的重要因素，但目前具体机制尚不十分清楚。载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE代表蛋白，APOE代表基因）是脑内的主要载脂蛋白，除了脂质代谢方面的作用外，具有重要的神经生物学功能。我们课题组及国外研究发现，APOE基因敲除鼠与野生鼠相比，颅脑损伤后脑组织易损性显著增加，提示APOE在颅脑损伤中发挥神经保护作用。但完整的apoE分子量大，正常状态下不能通过血脑屏障。COG1410是一种来源于ApoE受体结合区的人工合成小分子多肽，克服了apoE全蛋白不能通过血脑屏障的缺点，给予C0G1410可减少脑损伤后小鼠神经细胞凋亡，改善神经功能评分，从另一方面证实了ApoE与颅脑损伤的关系。但APOE影响颅脑损伤病情转归的机制尚不十分清楚，有待进一步研究。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介导的细胞凋亡是继传统受体途径和线粒体途径后倍受关注的细胞凋亡途径。适度的ERS可通过非折叠蛋白反应，增加分子伴侣表达，以抵抗应激，维持细胞存活；持续或强烈的应激将通过激活其特有的促凋亡途径介导细胞凋亡。而在颅脑损伤动物模型和体外实验研究表明，TBI后ERS水平上升。而在TBI患者，ERS介导的细胞凋亡是否与颅脑损伤有关尚未见报道。同时，Osada等在脑缺血的小鼠模型中发现，与WT鼠相比，APOE-/-鼠海马CA1-CA2区神经细胞凋亡明显增多，且ERS水平上升趋势更明显。但是，APOE是否影响TBI后ERS水平？给予外源性拟ApoE短肽是否能抑制ERS发挥其神经保护作用？国内外尚未见报道。因此，本研究通过观察TBI患者及探讨ERS在TBI中的作用及ApoE对TBI后ERS的影响及意义。在TBI患者采用免疫组化法检测CHOP颅脑创伤周围组织表达，并分析其与GCS评分及细胞凋亡关系；并进一步检测在APOE敲除鼠及野生鼠（含APOE）小鼠颅脑损伤模型中不同时间点ERS变化，同时观察C0G1410是否能改变TBI后ERS水平，应用TUNEL检测细胞凋亡，以探讨ApoE对TBI后内质网应激的影响及意义，从而为深入阐明ApoE在TBI后的神经保护作用提供实验资料。一、 CHOP在严重创伤性颅脑损伤患者中的表达及意义目的研究CHOP在严重创伤性颅脑损伤（TBI）患者中的表达，并探讨其与病情严重程度的关系。方法收集41例TBI患者颅脑创伤周围组织，并选取因其他疾病(排除TBI及其他中枢神经系统疾病)死亡的尸检标本16例作为对照组。TBI组颅脑损伤伤情程度根据入院时GCS评分分为重型TBI（GCS6-8分）组及特重型TBI组（GCS3-5）。采用免疫组化技术检测CHOP在颅脑创伤周围组织的表达，TUNEL检测神经细胞凋亡，并对CHOP表达水平与凋亡数量进行相关性分析。结果：与对照组相比，TBI组CHOP的表达显著上调（P0.05）。在TBI组中，特重型TBI组明显高于重型TBI组（P0.05）。TUNEL检测结果表明，TBI组较对照组神经细胞凋亡数量明显增加（P0.05），且CHOP表达水平与凋亡指数(r=0.72，P0.05)呈正相关。结论：TBI后CHOP表达水平病情严重程度、神经细胞凋亡密切相关，提示ERS介导的细胞凋亡途径可能在TBI的病理生理过程中起重要作用。二、颅脑损伤动物模型的建立：控制性皮质冲击损伤模型目的：建立一个可靠而稳定、重复性好的颅脑损伤模型。方法：建立小鼠控制性皮质冲击损伤模型。对损伤后小鼠进行神经功能评分，并从大体及显微镜下观察各组不同时间点形态学差异，判定颅脑损伤模型是否成功建立。结果：致伤组同假手术组及对照组相比，神经功能评分增加；形态学观察发现致伤组同假手术组及对照组相比，局部神经细胞凋亡、坏死明显增加，脑组织水肿、炎细胞浸润明显。结论：成功建立小鼠皮质冲击颅脑损伤模型，并通过神经功能评分及形态学观察进一步鉴定，表明所建立的小鼠颅脑损伤模型符合实验要求，为下一步研究提供模型保障。三、 ApoE对TBI后ERS的影响及意义目的：在颅脑损伤动物模型中进一步研究TBI后ERS水平的改变及APOE对TBI后ERS的影响及意义。方法：将APOE基因敲除鼠及野生鼠各72只随机分为假手术组、致伤组、COG1410干预致伤组（n=24），即APOE-/-假手术组、APOE-/-致伤组、APOE-/-致伤+COG1410组；WT假手术组、WT致伤组、WT致伤+COG1410组。各组按伤后灌注取脑时间又分为1d、3d、7d三个亚组（n=8）。Western blot、Real-timePCR检测内质网应激标记性分子GRP78及CHOP蛋白的表达，TUNEL检测神经细胞凋亡情况。再取APOE-/-鼠及WT鼠各27只随机分为假手术组、TBI组、COG1410干预致伤组，并进行神经功能评分（mNSS）。结果：1.与假手术组相比，WT致伤组GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表达均明显上调，GRP78表达于伤后1d达到高峰，而CHOP表达于伤后3d达到高峰。WT致伤组伤后神经细胞凋亡数量明显增加(P0.05)，且CHOP表达量与细胞凋亡指数呈正相关。mNSS评分在各时间点WT致伤组均高于假手术组。2.与WT致伤组相比，，APOE-/-致伤组伤后GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表达的上调趋势更明显，且细胞凋亡数量显著增多，mNSS评分增高(均P0.05)。3.给予COG14010后，APOE-/-鼠及WT鼠较各自基因型小鼠致伤组GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表达下降，且细胞凋亡减少，mNSS评分改善(均P0.05)。结论：ERS在TBI后被激活，与TBI后继发性颅脑损伤密切相关。敲除APOE基因后，ERS水平增加，细胞凋亡也增加，同时神经功能损害也更重；而给予外源性拟ApoE短肽COG1410后可抑制TBI后ERS水平，减少神经细胞凋亡，改善神经功能评分。表明APOE在颅脑损伤中的神经保护作用与抑制ERS水平密切相关，这也为更深入探讨ApoE神经保护机制增加了思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R651.15

【参考文献】