亚低温联合EPO对TBI大鼠脑保护作用的研究

发布时间：2018-11-01 18:57

【摘要】：研究目的：本实验利用液压打击装置成功建立大鼠颅脑创伤模型,并运用此模型进行：(1)、给与亚低温(mild hypothermia, MHT)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)治疗后,观察亚低温(MHT)、促红细胞生成素(EPO)单独及两者联合治疗对颅脑创伤大鼠神经功能缺陷评分、脑组织含水量、血脑屏障通透性的影响,探索亚低温(MHT)联合促红细胞生成素(EPO)应用的脑保护作用；(2)、给与亚低温(MHT)、促红细胞生成素(EPO)单独及两者联合治疗后,测定损伤灶周围脑组织AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3的含量变化,从而探索其与脑保护作用之间的关系及联合应用亚低温(MHT)、促红细胞生成素(EPO)脑保护作用的可能机制,为临床应用提供可靠的理论依据。研究内容与方法：本实验分为两个部分：试验一, MHT联合EPO治疗的脑保护作用的研究。实验二, MHT联合EPO治疗对颅脑创伤大鼠脑组织中AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3表达的影响。试验一：采用健康成年雄性Wistar大鼠40只,随机分成5组：假手术组(Sham组)仅做伤前准备而不予液压打击、常温治疗组(NT组)只致伤不降温、亚低温治疗组(MHT组)给予亚低温治疗、促红细胞生成素治疗组(EPO组)与规定时间给与EPO腹腔注射治疗、亚低温联合促红细胞生成素治疗组(MHT+EPO组)给与亚低温治疗,并在规定时间给与EPO腹腔注射治疗。术后48h所有大鼠进行神经功能评分(n=8),完毕后所有大鼠断头处死,干/湿比重法测定脑组织含水量(n=4);EvanS蓝测定法测定血脑屏障通透性改变(n=4)。实验二：采用健康成年雄性Wistar大鼠50只,随机分成5组：假手术组(Sham组)仅做伤前准备而不予液压打击、常温治疗组(NT组)只致伤不降温、亚低温治疗组(MHT组)给予亚低温治疗、促红细胞生成素治疗组(EPO组)与规定时间给与EPO腹腔注射治疗、亚低温联合促红细胞生成素治疗组(MHT+EPO组)给与亚低温治疗,并在规定时间给与EPO腹腔注射治疗。术后48h所有大鼠断头处死,采用HE染色法观察损伤病灶大小(n=3),采用蛋白印迹法(Western Blotting法)(n=3)和实时定量逆转录多聚酶链反应法(Real-time qPCR法)(n=4)分别测定脑组织AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3的表达情况,采用免疫组织化学方法测定脑组织中pAKT、pGSK3(3表达情况。结果：1.神经功能缺陷评分结果：依据改良神经功能损伤程度评分(mNSS)测定各组大鼠神经功能改变,与Sham组相比,其余四组神经功能缺陷评分明显增加,差异具有统计学意义(均P0.05),与NT组相比MHT组、EPO组及MHT+EPO组神经功能缺损评分均有明显减低(*P0.05,**P0.01)；与MHT组、EPO组相比MHT+EPO组神经功能缺陷评分明显降低,差异具有统计学意义(#P0.05)。 2.脑组织含水量测定结果：利用干/湿重法检测脑组织含水量,Sham组脑组织含水量为77.16±2.11%,NT组为83.23±1.99%；与NT组相比,MHT组、EPO组、MHT+EPO组脑组织含水量降低并具有统计学差异(NT vs. EPO,83.23±1.99%vs.80.43±2.38%; NT vs. MHT,83.23±1.99%vs.79.85±1.78%;NT vs. MHT+EPO,83.23±1.99%vs.78.12±1.34%)(P＜0.05,P＜0.01);与MHT组、EPO组相比,MHT+EPO组脑组织含水量降低并具有统计学差异(MHT vs. MHT+EPO,79.85±1.78%vs.78.12±1.34%;EPO vs. MHT+EPO,80.43±2.38%vs.78.12±1.34%)(#P＜0.05)。 3.血脑屏障(BBB)通透性测定结果：Evans蓝测定法检测BBB通透性,造模成功后,各组BBB通透性均增加(均P0.05),与NT组相比,MHT组、EPO组及MHT+EPO组BBB通透性减低,差异具有统计学意义(*P0.05,P0.01)；与MHT组、EPO组相比,MHT+EPO治疗组降低BBB通透性的作用更加显著(#P0.05)。 4.HE染色结果：NT组皮层损伤灶明显,灶内可见大量细胞核碎片聚集,海马部位神经细胞有胞体固缩,胞核不清、核拉长或呈三角形等不同程度损伤改变。与NT组相比MHT组、EPO组及MHT+EPO组皮层损伤灶减小,海马部位神经细胞有胞体固缩／胞核变形情况明显减少。 5.亚低温(MHT)、促红细胞生成素(EPO)单独及联合应用对颅脑创伤大鼠脑组织中AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3表达的影响：与NT组相比MHT组、EPO组及MHT+EPO组pAkt、pGSK3β、Claudin-5在蛋白水平表达明显升高,并差异具有统计学意义(*P0.05,**P0.01),而AKT、GSK3β在各组之问的表达差异无统计学意义(均为P0.05)；MHT组、EPO组及MHT+EPO组Claudin-5转录水平较NT组明显增加,差异具有统计学意义(*P0.05,**P0.01),且MHT+EPO组Claudin-5转录水平较MHT组、EPO组明显增加(#P＜0.05,##P＜0.01);MHT组、EPO组及MHT+EPO组Caspase-3转录水平较NT组明显降低(*P0.05,**P0.01),且MHT+EPO组Claudin-5转录水平较MHT组、EPO组减低明显(#P0.05,##P0.01)。结论：亚低温(MHT)及促红细胞生成素(EPO)均可降低颅脑创伤大鼠神经功能缺陷评分,减轻脑组织水肿,降低血脑屏障(BBB)通透性,上调了pAkt、 pGSK3β、Claudin-5的表达水平,并降低Caspase-3的表达水平,对颅脑创伤大鼠脑组织有保护作用,并且两种治疗联合应用上述作用更加明显。本研究提示PI3K/Akt/GSK3β信号通路参与了亚低温(MHT)、促红细胞生成素(EPO)的脑保护作用,为亚低温(MHT)、促红细胞生成素(EPO)的临床应用及推广提供了理论基础。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R651.15

【参考文献】