抑制人成纤维细胞ILK活性对其迁移、分化的影响

发布时间：2018-11-03 06:43

【摘要】：研究背景：创面愈合是皮肤出现缺损后，局部组织通过迁移、增殖、重塑，进行修复的病理生理过程。这一过程需要各种修复细胞与一系列细胞因子的相互作用来调控，其中成纤维细胞是重构真皮的主要效应细胞。因此，发生在成纤维细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间的大量复杂的生物反应是研究伤口愈合病理过程的重要部分。 ECM作用于细胞膜的主要受体是整合素，研究表明伤口愈合过程中会出现多种整合素表达增强，推测整合素可能参与创伤愈合过程的调控。整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）连接整合素胞内结构并促进细胞信号的级联反应。实验表明利用小分子干扰技术（siRNA）下调ILK蛋白的表达后可抑制肿瘤细胞的侵袭和恶化。另外，有研究发现ILK在转化生长因子β1（transformationgrowth factor beta1，TGF-β1）诱导小鼠肾脏纤维化进程中起重要作用。创面愈合肉芽组织形成的病理特征也是ECM沉积和成纤维细胞分化增生。本课题组前期研究已发现创面愈合与ILK的表达密切相关，但对ILK在创面愈合的作用和影响机制尚需进一步探讨。根据ILK蛋白氨基酸排列的特点，人工合成的蛋白小分子QLT0267能与胞浆中的ILK特异性结合并阻断其Ser473磷酸化位点，抑制其对蛋白激酶B（PKB/AKT）的磷酸化，降低磷酸化AKT（phosphorylation of AKT，pAKT）的量，调控细胞生物学改变。研究发现ILK特异性阻断剂QLT0267能有效地降低pAKT的蛋白量，影响肿瘤细胞、肾小管上皮细胞的迁移、分化增生和凋亡，推论ILK通过ILK-PKB/AKT途径调控细胞生理功能。ILK特异性抑制剂QLT0267的应用为研究ILK在创面愈合的作用机制提供了新的方向。本研究以人皮肤成纤维细胞为研究对象，应用QLT0267抑制ILK磷酸化AKT；同时利用siRNA技术降低ILK蛋白的表达，观察成纤维细胞的迁移和分化功能的改变，初步探讨ILK在创面愈合过程中的作用。第一部分不同浓度ILK特异性抑制剂QLT0267对人皮肤成纤维细胞的影响目的观察不同浓度的ILK特异性抑制剂QLT0267在不同时间点对成纤维细胞生物学特征的改变，确定后续实验的最佳药物浓度及观察时间点。方法收集整形术后剩余的皮肤标本，采用机械法加酶消化法分离培养成纤维细胞，利用ILK特异性抑制剂QLT0267降低ｐAKT的量，以不同终浓度药物作用于成纤维细胞，实验分为A空白对照组、B5nM QLT0267组、C10nMQLT0267组、D20nM QLT0267组、E30nM QLT0267组和F DMSO组（QLT0267溶剂）。分别于12、24、48、72h在倒置相差显微镜下观察细胞形态；CellTiter试剂盒检测24、48、72h时间点各组的增殖情况，并与空白对照组比较计算增殖抑制率；流式细胞仪检测48h时间点细胞凋亡情况，同时Western Blot法观察pAKT、tAKT蛋白的表达。对数据进行单因素方差分析和重复测量设计方差分析检验。结果经浓度大于10nM的ILK特异性抑制剂作用下成纤维细胞膨胀变圆，核固缩或破碎，并出现细胞凋亡，随药物刺激时间的延长和药物浓度的增加，改变更加明显。CellTiter试剂盒检测结果显示10nM以上的ILK特异性抑制剂QLT0267能抑制成纤维细胞的增殖（P＜0.05），且随着浓度的增高和刺激时间的延长，增殖抑制率也提高（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果显示与对照组相比较，10nM以上的ILK特异性抑制剂能诱导的成纤维细胞凋亡（P＜0.05）。Western Blot结果显示各药物浓度组的pAKT表达比空白对照组低，并随着药物浓度的上升而下降（P＜0.05）。各组成纤维细胞表达tAKT蛋白量的差异无统计学差异（P＞0．05）。结论ILK特异性抑制剂QLT0267能诱导成纤维细胞生物学特性的改变，通过降低pAKT的量而抑制细胞增殖、启动细胞凋亡。随着药物浓度的升高和刺激时间的延长，效果更明显。根据以上实验结果和后续实验要求，应用10nMQLT0267成纤维细胞刺激48h是后续实验的最佳实验条件。第二部分ILK对人皮肤成纤维细胞迁移能力的影响目的探讨ILK影响人皮肤成纤维细胞迁移能力的作用机制。方法体外培养成纤维细胞，设计及合成靶向ILK基因的siRNA序列，Lipofectamine2000转染试剂介导ILK-siRNA转染成纤维细胞以及采用终浓度为10nM ILK特异性抑制剂QLT0267刺激细胞48h。实验分为以下6组：A空白对照组、B转染载体组（Lipofectamine2000转染试剂）、C con-siRNA组、DILK-siRNA组、E ILK活性抑制组和F DMSO组（QLT0267溶剂）。以上各组行体外细胞划痕试验，目镜下观察划痕后0、12、24h时间点各组成纤维细胞向划痕区迁移的面积，计算细胞愈合率；RT-PCR检测各组细胞ILKmRNA的表达；Western Blot检测各组细胞ILK、 pAKT、tAKT蛋白的表达。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。结果体外细胞划痕实验结果显示划痕12h后ILK-siRNA组和ILK活性抑制组细胞愈合率显著低于空白对照组（P＜0.01），，两组组间比较无统计学差异（P＞0.05）。RT-PCR结果显示与空白对照组比较，通过小分子干扰能显著地抑制ILK基因的表达（P＜0.01）。Western Blot结果显示ILK-siRNA组ILK表达比其余各组显著降低（P＜0.01）；ILK-siRNA组与ILK活性抑制组的pAKT表达比其余各组降低（P＜0.05），两组组间比较无统计学差异（P＞0.05）；tAKT的表达各组均无统计学差异（P＞0.05）。结论应用小分子干扰技术能下调ILK蛋白的表达下调，而ILK蛋白的降低或磷酸化活性被抑制，均能降低pAKT蛋白的表达量。结合体外细胞划痕实验结果，推论ILK可能通过ILK-AKT途径影响成纤维细胞的迁移功能。第三部分ILK对TGF-β1刺激人皮肤成纤维细胞上调α肌动蛋白的影响目的探讨ILK对TGF-β1诱导成纤维细胞合成α-肌动蛋白（alpha-smoothmuscle actin，α-SMA）的影响，探讨ILK在成纤维细胞分化过程的作用。方法实验分为以下6组：A空白对照组、B转染载体组（Lipofectamine2000转染试剂）、C con-siRNA组、D ILK-siRNA组、E ILK活性抑制组和F DMSO组（QLT0267溶剂）。Western Blot检测各组成纤维细胞α-SMA蛋白的表达。再取常规培养成纤维细胞分为以下7组：1. TGF-β1组、2.转染载体+TGF-β1组、3.con-siRNA+TGF-β1组、4. ILK-siRNA+TGF-β1组、5. ILK活性抑制+TGF-β1组、6. DMSO+TGF-β1组、7.空白对照组。应用小分子干扰沉默ILK蛋白表达以及利用ILK特异性抑制剂QLT0267抑制ILK磷酸化活性，按第二部实验分组方法处理1~6组后，再用5ng/ml TGF-β1加入1~6组刺激24h，Western Blot检测各组α-SMA、ILK蛋白的改变。数据进行单因素方差分析和t检验。结果ILK-siRNA组和ILK活性抑制组的α-SMA蛋白比空白对照组明显低（P0.05），两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。TGF-β1组的α-SMA比空白对照组有所上升（P0.05）。ILK-siRNA+TGF-β1组的ILK比TGF-β1组低（P0.05）。ILK-siRNA+TGF-β1组和ILK活性抑制+TGF-β1组的α-SMA蛋白比TGF-β1组低（P0.05），两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论ILK蛋白下调或其磷酸化活性受限能降低成纤维细胞合成α-SMA蛋白。TGF-β1可刺激成纤维细胞加快向肌成纤维细胞方向分化，但ILK表达下调或ILK活性受抑制均可减弱其刺激成纤维细胞分化的作用，推断ILK通过参与TGF-β1诱导成纤维细胞的分化而影响创面愈合的效果。
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【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R641

【参考文献】