脐带MSC来源exosome在皮肤组织再生中的作用及机制

发布时间：2018-11-07 12:40

【摘要】：目的：烧烫伤是日常生活常见的一种创伤,具有高发病率和死亡率；有报道证实脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSC)加速损伤皮肤的创面愈合,然而MSC的保存、运输及安全性等问题限制了其临床应用；外泌体(exosome)是hucMSC旁分泌的主要成分,hucMSC-exosome(hucMSC-Ex)在皮肤组织再生中的作用尚未报道。本研究旨在探明hucMSC-Ex促进深Ⅱ度烫伤的修复作用以及阐明exosome促进皮肤再生过程中信号转导的机制。方法：贴壁法分离培养hucMSC细胞,蔗糖密度梯度离心法分离hucMSC-Ex,通过Western blot分析hucMSC-Ex表面标记CD63CD81和CD9的表达,透射电镜观察hucMSC-Ex形态和大小,Nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测hucMSC-Ex的直径分布情况。80℃热水烫伤8s制作SD大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型并应用hucMSC-Ex治疗,通过创面大体、HE染色、PCNA和CK19的组织化学染色等方法分析其修复效果；Western blot检测Bcl-2、Bax表达和流式细胞术Annexin V/PI双染等技术分析细胞凋亡；细胞计数检测细胞增殖；划痕实验分析细胞的迁移；流式细胞术PI染色分析细胞周期；通过P13K的抑制剂LY294002证明AKT通路在hucMSC-Ex促进皮肤组织再生中的作用；通过β-catenin抑制剂ICG001证明Wnt/β-catenin信号的作用；应用慢病毒载体介导的shRNA干扰hucMSC-Ex及hucMSC中的Wnt4验证其在深度烫伤修复中作用。应用免疫组化和免疫荧光检测皮肤组织中CK15、CK19、Integrin a6、CD44、Oct4及Nanog的表达,以标记干细胞的数量；定量RT-PCR检测皮肤组织中胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达,Masson染色分析组织中胶原的沉积,皮肤组织和真皮细胞α-SMA的免疫荧光检测真皮成纤维细胞(DFL)向纤维母细胞的分化；免疫荧光和细胞核质蛋白分离检测分析β-catenin和YAP在细胞中定位；TopFlash检测β-catenin的转录活性,YAP-TEAD4荧光素酶报告基因系统检测YAP的转录活性；流式细胞术分析CD44在DFL细胞的表达情况；定量RT-PCR分析YAP的靶基因CTGF及Cy61的]mRNA表达；免疫组化检测p-YAP和YAP在皮肤组织中的表达和定位；将YAP的Ser127和LATS的Thr1079位点突变为丙氨酸,以证明此磷酸化位点的功能：液相质谱分析(LC/MS)分析hucMSC-Ex内14-3-3ζ等成分,shRNA敲减14-3-3ζ、α-catenin、YAP、LATS 1/2等分子,腺病毒过表达14-3-3ζ和YAP,以证明它们的功能；通过免疫共沉淀技术(IP)检测14-3-3ζ、YAP、p-LATS等蛋白间相互作用。结果：成功分离得到hucMSC-Ex,电镜观察其形态为球形,Nanosight分析其直径为100nm左右,表达CD63、CD81和CD9等标记；成功建立SD大鼠皮肤深ⅡI度烫伤模型,hucMSC-Ex加快深Ⅱ度烫伤皮肤创面愈合,促进皮肤组织细胞的增殖和表皮的再生化,同时促进皮肤组织胶原的合理分布；hucMSC-Ex逆转热激损伤引起的细胞凋亡,促进体外细胞扩增；对MAPK通路和AKT通路的筛检发现,hucMSC-Ex显著地的活化AKT信号通路,Luminex检测发现hucMSC-Ex中存在包括VEGF等多种可能活化AKT信号的细胞因子；P13K的抑制剂LY294002可以逆转hucMSC-Ex对细胞凋亡的降低作用,但没有改变hucMSC-Ex对皮肤细胞周期和细胞迁移的促进作用：进一步研究表明,hucMSC-Ex可以活化Wnt/β-catenin信号,并且β-catenin的抑制剂ICG001逆转hucMSC-Ex对皮肤损伤的修复作用；将hucMSC-Ex中的Wnt4敲减后(Wnt4-shRNA-Ex),hucMSC-Ex促进皮肤细胞分裂、迁移和加速深Ⅱ度烫伤创面愈合的作用消失。对exosome治疗深Ⅱ度烫伤模型长期观察可以发现,hucMSC-Ex对皮肤细胞增殖和β-catenin活化呈现先促进后抑制的现象,同时发现hucMSC-Ex在修复的后期限制皮肤干细胞的扩增、真皮细胞中α-SMA的表达和胶原ⅢⅢ1的沉积；体外研究发现,hucMSC-Ex对细胞增殖和β-catenin入核的抑制作用依赖于高细胞密度培养条件,hucMSC-Ex抑制在此培养条件下生长的DFL中a-SMA表达和胶原的沉积;进一步研究发现,hucMSC-Ex通过促进YAP的磷酸化而诱导YAP的胞质内滞留,hucMSC-Ex对β-catenin抑制作用依赖于YAP Ser127位点的磷酸化；对hucMSC-Ex的液相质谱分析(LC/MS)发现14-3-3ζ,此蛋白在Hippo通路中有调控作用,hucMSC-Ex中敲减14-3-3ξ的表达逆转了hucMSC-Ex对YAP Serl27位点磷酸化的促进作用和体外细胞增殖抑制作用,hucMSC-Ex中过表达14-3-3ζ得到相反结果；将细胞中LATS干扰后或者将LATSThr1079位点突变后,14-3-3ζ对YAP磷酸化的促进作用降低；14-3-3ζ、YAP、p-LATS三者可以形成复合物,YAP与其上游激酶p-LATS的结合依赖于14-3-3ζ蛋白；应用14-3-3ζ敲减的hucMSC-Ex(shl4-3-3ζ-Ex)治疗深度烫伤模型发现,sh14-3-3ζ-Ex比对照exosome表现出更强的促增殖能力,修复后皮肤组织表皮层异常增厚、附属结构较少、纤维母细胞的分化和胶原沉积增多。结论：HucMSC-Ex通过转运Wnt4活化皮肤的β-catenin信号促进皮肤深Ⅱ烫伤模型的修复；hucMSC-Ex中介导的14-3-3ζ通过加强Hippo-YAP通路协调自身Wnt4信号,预防损伤后皮肤组织过度增生和疤痕形成。
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【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R644

【参考文献】