脓毒症时中枢性高迁移率族蛋白B1对外周细胞免疫反应的负向调控效应与机制的研究

发布时间：2018-11-16 18:43

【摘要】：目的本课题旨在研究脓毒症时脑组织高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)表达和胆碱能神经活性的变化规律,进而探讨中枢性HMGB1在脓毒痘免疫功能障碍中的作用及其与胆碱能抗炎通路的关系。方法1.将40只大鼠随机分为正常组、假伤组、盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP) 24h组和CLP 48 h组。大鼠于CLP术后24 h、48 h处死,取出整脑并依次分离皮层、海马、纹状体和丘脑.采用蛋白印迹分析(Western blot)、PCR和组织免疫荧光检测脑组织HMGB1的表达变化,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各脑区胆碱能活性指标(AchE、Ach和ChAT)变化。2.将80只大鼠随机分为正常组、假伤组、HMGB1 (1μg)组和HMGB1 (10μg)组,分24 h、48 h两个时间点,每组10只。 各纽大鼠分别于侧脑室HMGB1刺激后24 h、48 h断颈处死并立即于无菌超净台中消毒表面皮肤,无菌取出脾脏,分选出脾脏调节性T细胞(Treg)、树突状细胞(DC)和CD4+T细胞,采用流式细胞术、细胞计数检测法(CCK8法)和ELISA法分别检测Treg和DC表型、T细胞增殖活性及细胞因子分泌的变化。3.将60只大鼠随机分为正常组、假伤组(Sham+NS)、脓毒症组(CLP+NS)和脓毒症+BoxA组(CLP+BoxA),分24 h、48 h两个时间点,每组10只. 各组大鼠预先行侧脑室置管,后分别行假伤或CLP术后立即给予侧脑室(NS或BoxA),术后24 h、48 h断颈处死并立即于无菌超净台中消毒表面皮肤,无菌取出脾脏,分选出脾脏调节性T细胞(Treg)、树突状细胞(DC)和CD4+T细胞,采用流式细胞术、细胞计数检测法(CCK8法)和ELISA法分别检测Treg和DC表型、T细胞增殖活性及细胞因子分泌的变化。4.实验分为侧脑室高迁注射和脓毒症中枢BoxA干预两部分。在侧脑室高迁注射实验中,将16只野生型雄性C56BL/小鼠和16只α7 nAChR敲除雄性C56BL/6小鼠编号、称重,按随机原则分别分成对照组和HMGB1 1微克组,每组8只。在脓毒症中枢BoxA干预实验中,将24只野生型雄性C56BL/小鼠和24只α7nAChR敲除雄性C56BL/6小鼠编号、称重,按随机原则分别分成假伤组、CLP组和CLP中枢BoxA干预组,每组8只。实验中各组小鼠的处理同前面实验部分,各组小鼠于术后24 h断颈处死并立即于无菌超净台中消毒表面皮肤,无菌取出脾脏,分选出脾脏调节性T细胞(Treg),采用流式细胞术、CCK8法和ELISA法分别检测Treg表型、T细胞增殖活性及细胞因子分泌的变化。结果1.脓毒症组与假伤组比较皮层、海马、纹状体、丘脑脑组织HMGB1表达明显增加(皮层：P0.05；海马：P0.05；纹状体：P0.01；丘脑：P0.01)；脓毒症24 h组与脓毒症48 h相比,各部分组织HMGB1表达无明显差异。脓毒症组与假伤组比较各部分脑组织胆碱能活性指标明显增加：AchE(皮层：P0.05；海马：P0.05；纹状体：P0.05丘；脑：P0.05),Ach(皮层：P0.01；海马：P0.01；纹状体：P0.05丘；脑：P0.01),ChAT(皮层:P0.01；海马：P0.01；纹状体：P0.01丘；脑：P0.01)；脓毒症24 h组与脓毒症48 h相比,各部分组织胆碱能活性指标无明显差异。2.中枢HMGB1对大鼠外周Treg、DC和CID4+T细胞免疫功能的影响：(1)HMGB1 1μg组与假伤组比较Treg细胞Foxp3的表达和IL-10的分泌于48小时增加(P0.01-0.05); HMGB1 10μg组与假伤组比较Treg细胞Foxp3和CTLA-4表达上调,对T细胞增殖抑制功能增强, TGF-p和IL-10分泌增加,各指标于24h和48h差异显著(P均小于0.01).(2)HMGB1 1μg组与假伤组比较DC细胞CD80、MHCⅡ表达降低,于24和48h差异显著(P均小于0.05)；HMGB1 10μg组与假伤组比较DC细胞CD80、CD86和MHC II表达降低,促T细胞增殖能力降低,各指标于24和48h差异显著(P均小于0.01)。(3)HMGB1lpg组与假伤组比较CD4+T细胞IFN-γ,分泌减少,IL-4分泌增加,各指标于24h差异显著(P均小于0.05)；HMGB1 10μg组与假伤组比较CD4+T细胞增殖活性减弱,IL-2和IFNq,分泌减少,IL-4分泌增加,各指标于24和48h差异显著(P均小于0.01)。3.中枢BoxA对脓毒症大鼠外周Treg、DC和CD4+T细胞免疫功能的影响：(1)CLP组与假伤组比较Treg细胞Foxp3和CTLA-4表达上调,对T细胞增殖抑制功能增强, TGF-β和IL-10分泌增加,各指标于24和48h差异显著(P均小于0.01); CLP+BoxA组与CLP组比较Treg细胞Foxp3和CTLA-4表达下调,对T细胞增殖抑制功能减弱,TGF-p和IL-10分泌减少,各指标于24和48h有差异(P均小于0.01)。(2)CLP组与假伤组比较DC细胞CD80、CD86和MHCⅡ表达降低,促T细胞增殖能力减弱,各指标于24和48h差异显著(P均小于0.01)；CLP+BoxA组与CLP组比较DC细胞CD80、CD86和MHC II表达升高,促T细胞增殖能力增强,各指标于24和48h有差异(P0.01-0.05)。(3)CLP组与假伤组比较CD4+T细胞增殖活性减弱,IL-2和IFN-γ分泌减少,IL-4分泌增加,各指标于24和48h差异显著(P均小于0.01); CLP+BoxA组与CLP组比较CD4+T细胞增殖增加,IL-2和IFN吖分泌增多,IL-4分泌减少,各指标于24和48h有差异(P0.01-0.05)。4.a7 nAChR在脓毒症时中枢HMGB1调节外周Treg细胞功能中的作用：(1)在野生型小鼠中,HMGB1刺激组与假伤组比较外周脾Treg细胞Foxp3和CTLA-4上调,对T细胞抑制能力增强,TGF-p和IL-10分泌增加(P均小于0.01)；在α7nAChR敲除小鼠中,HMGB1刺激组与假伤组比较外周脾Treg细胞Foxp3上调(P0.01),其余指标无明显差异.(2)在野生型小鼠中,CLP+BoxA组与CLP组比较Treg细胞Foxp3和CTLA-4表达减少,TGF-β和IL-10分泌减少,T细胞抑制功能减弱(P0.01-0.05)；在a7 nAChR敲除小鼠中,CLP+BoxA组与CLP组比较Treg细胞各指标差异不明显。结论1.脓毒症时各脑区组织HMGB1表达增加,且胆碱能活性指标水平升高；2.脓毒症时中枢HMGB1的表达增加可导致脾Treg抑制功能增强,介导DC和T细胞免疫功能受损;3中枢水平拮抗HMGB1可降低脓毒症时脾Treg的抑制功能,改善DC和T细胞；4脓毒症时中枢HMGB1可经胆碱能抗炎通路调节外周Treg细胞功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7

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本文编号：2336324