【摘要】：脓毒性脑病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是感染后全身炎症反应所致的弥漫性大脑功能障碍和意识改变,是多脏器功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的重要组成部分及患者预后不良的独立危险因素。SAE的病因和病理机制非常复杂,以白细胞浸润、神经元细胞变性坏死、星型胶质细胞和小胶质细胞激活为标志的炎症反应起到了重要的作用。其中星形胶质细胞在中枢神经系统损伤后呈现保护或毒性作用的“双相”性及活化的时空性特点和SAE的临床表现有很好的契合性。星形细胞激活后出现反应性胶质化(reactive gliosis)、增殖迁移等状态,胞内游离ca2+浓度的升高起了重要作用。星形细胞过度活化可诱发凋亡,其中定位于线粒体参与非Caspase依赖凋亡途径的BNIP3/AIF/EndoG通路介导神经凋亡亦被证实和钙超载有关。瞬时感受器电位M2型(Transient Receptor Potential2Channels,TRPM2)通道是位于细胞膜上的一种多功能钙离子通透性的非选择性阳离子通道,通过调节胞内钙离子浓度可以调节氧化应激或再灌注等病理损伤中的细胞死亡。TRPM2通道很可能参与调节了LPS诱导的星形胶质细胞的活化和凋亡。本研究通过建立LPS腹腔注射致小鼠脑内炎症的模型及引入[RPM2基因敲除小鼠,研究脓毒症在小鼠脑内的炎症改变及星形胶质细胞增殖和胶质化的时间规律,TRPM2在LPS致炎小鼠脑内星形胶质细胞增殖和胶质化的调节作用及参与BNIP3/AIF/EndoG介导LPS致炎小鼠海马区神经细胞的凋亡；以及通过星形胶质细胞培养及TRPM2-siRNA转染,进一步研究LPS是否可以诱导星形胶质细胞的适应性表达,以及TRPM2-siRNA转染是否可以有效抑制LPS诱导的体外星形胶质细胞的活化和致炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。从而明确星形胶质细胞TRPM2通道与脓毒性脑病的关系和分子机制,期待为防治脓毒症及脓毒性脑病提供理论依据。 目的： 研究LPS致炎后野生型和基因敲除(TRPM2)小鼠的一般行为学、脑内炎症改变、星形胶质细胞活化、促炎因子分泌及凋亡的差异；同时研究LPS诱导后星形胶质细胞TRPM2的表达特点及基因沉默后的差异,探讨LPS致炎对小鼠星形胶质细胞的活化影响、诱导TRPM2的适应性表达及TRPM2通道在星形胶质细胞活化中的作用及对神经细胞凋亡的影响。 方法： 1.动物模型：成年雄性C57BL/6小鼠野生型小鼠分别腹腔注射LPS5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg;对照组注入等量生理盐水。监测小鼠体温、神经行为学改变、惊厥发作、摄食改变及死亡率；24h后取脑HE染色观察神经元及胶质细胞病理变化特点和观察脑膜、脑室及脑实质炎症反应；免疫荧光检测小鼠海马区GFAP阳性细胞数量；TUNEL法检测小鼠海马区神经细胞凋亡。 2.在体实验：成年雄性C57BL/6小鼠野生型及同种系TRPM2小鼠分别腹腔注射LPS50mg/kg,对照组注入等量生理盐水,监测小鼠一般神经行为学改变、死亡率；并于注射后12h,24h,48h时间点取小鼠脑组织,通过免疫组化、Western blot方法检测LPS致炎后12h,24h,48h时间点野生型及TRPM2小鼠大脑海马区GFAP和TRPM2的表达变化和差异；荧光定量RT-PCR技术检测不同实验组小鼠脑组织TNF-a, IL-1β,IL-6mRNA的表达变化；Western blot方法检测海马BNIP3/AIF/EndoG的蛋白质表达变化。 3.离体实验：培养纯化鉴定小鼠星形胶质细胞；MTT法检测不同浓度(LPS: Oμg/ml,1.0μg/ml,3.0μg/ml,5.0μg/ml,7.0μg/ml,10.0μg/ml,12.0μg/ml,15.0μg/ml)及不同时间(2h,6h,12h,24h,2d及3d)LPS刺激后星形胶质细胞存活率；免疫荧光法检测星形胶质细胞GFAP的表达,荧光定量RT-PCR法检测TRPM2-mRNA的表达,Western blot方法检测TRPM2蛋白的表达,ELISA法检测星形细胞培养液细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)浓度变化。以75ng TRPM2-siRNA和3μl HiPerFect Transfection Reagent转染星形胶质细胞进行基因沉默,以10.0μg/ml LPS分别诱导细胞0h、24h、48h后,荧光定量RT-PCR技术检测小鼠星形胶质细胞上TRPM2mRNA表达水平的变化,Western blot方法检测TRPM2蛋白表达,ELISA法检测星形胶质细胞培养液细胞因子(TNF-a, IL-1β, IL-6)浓度。 结果： 1.小鼠LPS腹腔注射后有相应体温改变,出现相应神经行为学改变及惊厥发作、拒食现象以及死亡,均较对照组明显,其中LPS (50mg/kg)腹腔注射组死亡率达到33.3%；LPS致炎后小鼠脑内出现典型炎症性病理改变,TUNEL结果还发现小鼠海马区神经元出现凋亡现象较对照组显著(P0.05)；随着LPS刺激剂量增加小鼠海马区GFAP阳性细胞数显著增加,细胞胞浆明显增加、突起增多(P0.05)。 2.野生型小鼠海马区GFAP阳性细胞数与TRPM2表达在脓毒症脑损伤后显著增加,LPS致炎野生型(L组)GFAP与TRPM2表达在12h即有增多,24h达到高峰,48h略有减少,均较生理盐水对照组(S组)显著增多(P0.05)。LPS致炎后TRPM2基因敲除小鼠较野生型病死率增加,一般神经行为学指标改善。 TRPM2基因敲除小鼠GFAP表达在脓毒症脑损伤后显著降低,TRPM2基因敲除LPS致炎组(KO/L组)小鼠海马区GFAP阳性细胞较野生型LPS致炎组(L组)显著减少(P0.05)。小鼠海马区可见GFAP细胞与TRPM2细胞有共聚现象。 LPS致炎后24h TRPM2基因敲除较野生型小鼠脑组织TNF-α,IL-1β, IL-6mRNA的表达下降。 脓毒症脑损伤后4个实验组小鼠海马区BNIP3(F(3.16)=176.53, P0.01、AIF (F(3.16)=98.61, P0.01)\EndoG (F(3,16)=60.55, p0.01)表达均有显著性差异。BNIP3蛋白质表达L组较S组显著增加(P0.05),KO/L组较KO/S组(P0.05)和L组(P0.05)均显著降低,S组与KO/S组比较无统计学差异(P0.05)。AIF蛋白质表达L组较S组显著增加(P0.05),KO/L组较KO/S组(P0.05)和L组(P0.05)均显著降低。Endo G蛋白质表达L组较S组显著增加(P0.05),KO/L组较L组显著降低(P0.05),S组与KO/S组比较无统计学差异(P0.05)。 3.不同浓度LPS刺激24h后星形胶质细胞存活率差异具有统计学意义(F(7,72)=9.39,P0.01)；持续刺激24h后10.0μg/ml浓度的LPS是星形胶质细胞增殖活性的临界点。不同刺激时间点的星形胶质细胞存活率差异具有统计学意义(F(1,18)=6.41,P0.05),早期随着LPS刺激时间的延长,星形胶质细胞增殖活性逐渐增加,且刺激24h时达高峰,在LPS刺激48h以后星形胶质细胞增殖活性明显降低,至72h达到最低。故10.0μg/ml浓度LPS刺激48h是星形胶质细胞从增殖转向凋亡的临界点。 LPS不同刺激时间点星形胶质细胞培养液中细胞因子TNF-a (F(1.18)=66.21, P0.01)、IL-1β(F(1.18)=430.76, P0.01)、IL-6(F(1.18)=12725.06, P0.01的浓度变化具有统计学意义。LPS刺激12h后培养液中TNF-a浓度显著上升,6h后IL-1β浓度显著上升,2h后IL-6浓度显著上升。LPS能诱导星形胶质细胞TRPM2mRNA和TRPM2蛋白表达显著增加(P0.05)。 TRPM2-siRNA转染能显著降低星形胶质细胞TRPM2mRNA和TRPM2蛋白表达(P0.05)。TRPM2-siRNA转染后细胞GFAP蛋白表达显著低于非转染组细胞GFAP蛋白表达(P0.05)。TRPM2-siRNA转染能抑制LPS诱导星形胶质细胞分泌TNF-a, IL-1β和IL-6。LPS+TRPM2-siRNA组TNF-a, IL-1β和IL-6浓度较LPS组均显著降低(P0.05)。 结论： 1.小鼠LPS (50mg/kg)腹腔注射建模可诱发明显的脑内炎症和神经行为学改变,并最接近临床脓毒症标准。 2.LPS可诱导星形胶质细胞增殖、胶质化及凋亡,并在时间上有一定的规律性；LPS可诱导星形胶质细胞TRPM2-mRNA和TRPM2蛋白的表达,这种表达在星形胶质细胞属于适应性表达；TRPM2通道参与LPS致炎小鼠脑内星形胶质细胞增殖和胶质化调节、星形胶质细胞致炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌调节及可能参与了BNIP3/AIF/EndoG介导的LPS致炎小鼠海马区神经细胞凋亡。 3.PRPM2-siRNA转染基因沉默后可以有效抑制LPS诱导的体外星形胶质细胞TRPM2-mRNA和TRPM2蛋白的表达；抑制LPS诱导的体外星形胶质细胞的活化和致炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R459.7
【共引文献】
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本文编号：
2361209
