Protectin DX对脓毒症小鼠的治疗作用及其相关机制研究

发布时间：2018-11-27 18:18

【摘要】：第一部分Protectin DX对脓毒症小鼠的生存率以及多器官损伤的影响目的：探讨不同剂量Protectin DX (PDX)对脓毒症小鼠生存率以及重要器官损伤的影响。方法：第一部分：建立小鼠脓毒症模型,观察不同剂量Protectin DX对脓毒症小鼠生存率的影响。采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)建立小鼠脓毒症模型：60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为5组,每组各12只小鼠。(1)Sham组：小鼠行假手术,术后1h腹腔注射100μl生理盐水：(2)CLP组：小鼠行CLP术,术后1h腹腔注射100μl生理盐水;(3)CLP+ 100ng PDX组：小鼠行CLP术,术后1h腹腔注射100ng PDX; (4) CLP+300ng PDX组：小鼠行CLP术,术后1h腹腔注射300ng PDX; (5)CLP+1000ng PDX组：小鼠行CLP术,术后1h腹腔注射1000ngPDX;术后每24小时记录一次小鼠死亡数量,直至术后第八天。第二部分：探讨PDX对脓毒症小鼠重要器官损伤以及全身炎症反应的影响。30只雄性C57BL/6J小鼠随机分三组：(1)Sham组：小鼠行假手术,术后1h腹腔注射100μ1生理盐水：(2)CLP组：小鼠行CLP手术,术后1h腹腔注射100μl生理盐水;(3) CLP+PDX组：小鼠行CLP术,术后1h腹腔注射300ng PDX。在术后24小时处死小鼠,取小鼠肺、肝、肾等重要器官以及外周血和腹腔灌洗液(peritoneal lavage fluid, PLF)。采用HE染色评估肺、肾、肝等重要器官的组织病理损伤：采用生化分析仪检测血清谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、肌酐(creatinine, Cr)及尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)水平。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和PLF中炎症因子(TNF-α,IL-6,MCP-1和IL-10)水平。结果：(1)CLP诱导的脓毒症小鼠8天生存率为25%;PDX300ng和1000ng可分别提高脓毒症小鼠8天生存率至66.7%和75%；PDX100ng组8天生存率为41.67%,和CLP组相比,差异无统计学意义。(2)CLP组中小鼠肺、肾、肝等器官明显损伤,病理学评分显著降低；血清中ALT、AST、Cr和BUN水平明显增高；血清和PLF中的炎症因子(TNF-α,IL-6,MCP-1、IL-10)水平均明显升高；PDX300ng明显减轻CLP诱导的重要器官(肺、肾、肝)损伤；降低血清中ALT、AST、Cr和BUN水平：降低血清和PLB中促炎因子(TNF-α、IL-6、 MCP-1)水平,提高抑炎因子IL-10水平。结论：PDX可明显提高脓毒症小鼠生存率,减轻脓毒症引起的重要器官损伤并降低全身和局部炎症因子水平。第二部分PDX调节腹腔巨噬细胞分型促进脓毒症小鼠炎症消退目的：探讨PDX对脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞分型以及吞噬功能的影响。方法：C57BL/6J小鼠随机分为三组,每组各7只小鼠：(1) sham组：小鼠行假手术,术后1h腹腔注射100μl生理盐水；(2)CLP组：小鼠行CLP术,术后1h腹腔注射100μl生理盐水;(3) CLP+ PDX组：小鼠行CLP术,术后1h腹腔注射300ng PDX。术后24小时处死小鼠,取小鼠外周血和腹腔灌洗液(PLB)做相关检测。采用血培养板检测小鼠外周血和PLF中细菌负荷；吉姆萨(Giemsa)染色法观察PLF中中性粒细胞和单核／巨噬细胞数目的变化：流式细胞学检测PLF中巨噬细胞M1和M2分型情况以及巨噬细胞吞噬功能：Western Blot检测PLF中巨噬细胞M2型标志物精氨酸酶-1(Arginase 1,Argl)和几丁质酶-3样蛋白-3(Chitinase 3-like 3,Argl)以及过氧化物酶增殖活化受体-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor-y, PPAR-y)的表达水平。结果：与对照组相比,CLP组小鼠外周血及PLF中培养出大量细菌负荷,PBL中白细胞总数,中性粒细胞数目和单核巨噬细胞数目显著增加,巨噬细胞吞噬活性增强;PLF中M1型巨噬细胞增多,M2型巨噬细胞减少：巨噬细胞表达Argl、Argl和PPAR-γ水平降低。给予PDX处理明显减少脓毒症小鼠外周血及PBL中的细菌负荷,减少PLF中性粒细胞数量,增加单核巨噬细胞与中性粒细胞比例；增强巨噬细胞吞噬活性增强。与CLP组相比,PDX组小鼠PLF中M1型巨噬细胞减少,M2型巨噬细胞显著增多；并且PLF中巨噬细胞表达Argl、Argl和PPAR-γ水平明显增高。结论：PDX通过调节腹腔巨噬细胞向M2极化,增强巨噬细胞吞噬功能,从而降低全身和局部细菌负荷,促进炎症消退增加。第三部分PDX诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7向M2型巨噬细胞极化目的：研究PDX对小鼠巨噬细胞系RAW264.7极化的影响以及相关信号通路。方法：第一部分：观察不同剂量PDX对RAW264.7极化的影响。将RAW264.7细胞系随机分为4组：(1)对照组：加入PDX的溶剂作为对照；(2)PDX(10nM)组：加入PDX使其终浓度为10nM；(3)PDX(100nM)组：加入PDX使其终浓度为100nM; (4)PDX(1000nM)组：加入PDX使其终浓度为1000nM;Western blot和免疫荧光检测RAW264.7细胞的M2型巨噬细胞标志物(Arg1和Ym1)以及PPARγ表达水平;第二部分；探讨PDX诱导RAW264.7细胞向M2型极化的信号通路。将RAW264.7细胞系随机分为4组：(1)对照组：加入PDX的溶剂作为对照：(2)PDX(100nM)组：加入PDX使其终浓度为100nM;(3)PDX(1000nM)组：加入PDX使其终浓度为1000nM; (4)PDX+ GW9662组：在加入终浓度为1000nM PDX处理前30min加PPARγ阻断剂GW9662 1μM。 Western blot和免疫荧光检测RAW264.7细胞的M2型标志物(Argl和Ym1)以及即ARγ表达水平。结果：PDX刺激引起RAW264.7细胞M2标志物Arg1和Yml表达增多,以及PPARγ表达上调。阻断PPARγ表达可以消除PDX诱导的M2型标志物Arg1和Yml表达增多结论：PDX可以诱导细胞RAW264.7细胞向M2巨噬细胞极化,其作用是通过激活PPARy信号通路实现的。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7

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