移植血管内皮祖细胞对创伤后大鼠脑组织水肿及预后的影响

发布时间：2018-12-12 23:06

【摘要】：背景： 自从Asahara等人于1997年第一次从外周循环血液中分离提取出CD34,后来学者们发现其有向血管内皮细胞分化的趋势,并能向创伤组织迁移归巢随之将其命名为血管内皮祖细胞[1],它属于多能干细胞的一种,定植于骨髓之中,在创伤后向靶区域迁移并分化成为成熟的血管内皮细胞,其表达CD34+/CD133+,这一发现使人们对血管新生有了一个崭新的认识,并从血管新生的源头来思考促进血管再生以及治疗缺血性疾病的方法。 近年来,EPCs的生理学特性及临床应用价值越来越多地成为研究的热点,Warner等发现在急性心肌梗死的患者中外周血EPCs含量明显增加,并且其数量越高,发生心血管事件的概率及病死率就越低[2],EPCs已成功的在一些缺血性疾病,如肢体缺血性疾病、心血管疾病、原发性肺动脉高压等疾病中得到应用。其促进血管新生主要有两个方面的机制：一是可以直接分化为新生血管,二是可分泌血管内皮生长因子(VEGF)来促进这一过程,移植外源性血管内皮祖细胞或者使用一些促血管生成的药物来提高外周血中EPCs的含量,可明显改善缺血性疾病,尤其是外周血管性疾病以及心血管疾病中患者的预后。但在脑组织缺血,特别是创伤后脑组织缺血中的研究和应用却很少。国内外文献报道了大量关于外伤后脑梗塞的预后分析与治疗经验,证明在创伤后的脑组织中存在缺血与局部循环障碍,使用促进血管再生的药物或可改善这一病理过程从而改善预后。 在脑创伤研究领域,研究方向多集中在神经再生、脑保护及抑制脑水肿方面,其中血管源性脑水肿(VBE)被公认为是脑创伤及脑出血后最常见的一种脑水肿类型,也是引起脑疝导致死亡的主要原因,血管源性脑水肿的形成大多数情况下与血脑屏障遭到破坏,毛细血管通透性增加,血浆蛋白及水分渗出增加有关,而这一过程主要集中在局部微循环中,有学者担心新生的毛细血管会增加血浆蛋白及水分的渗出从而加重脑水肿的形成,甚至有人尝试使用抑制血管再生的药物来缓解创伤后脑组织水肿[4],而疗效较常规脱水、激素、抑肽酶等药物尚未肯定。反而增加了外伤后脑梗塞形成的风险,以至于学界对脑创伤后是否应该使用促血管生成药物未达成共识。 目的： 1.体外培养和鉴定大鼠外周血来源的EPCs。 2.通过鼠尾静脉移移植EPCs到脑损伤大鼠,观察对创伤区新生血管的影响。 3.测定大鼠脑含水量来估不同组别大鼠脑水肿程度。 4.神经功能评分来判断移植EPCs后血管新生、大鼠脑水肿程度以及预后的相关性。 方法： 1.EPCs提取、体外培养及鉴定：开胸采集大鼠外周静脉血,抗凝后梯度离心分离单核细胞,接种于包被纤维连结蛋白的64孔板,37°贴壁培养培养两天,每3天换液一次,倒置荧光显微镜观察细胞形态,CD34+、CD133+、vWF等内皮祖细胞标志物的表达,采用荧光素标记的乙酰低密度脂蛋白摄取试验和荆豆凝集素(FITC-UEA-1)结合实验鉴定内皮祖细胞功能,流式细胞仪检测阳性细胞所占比率。 2.大鼠脑损伤模型制作：选用SD成年大鼠120只,分为手术组和假手术组,手术组又分为EPCs组,抑制血管生成组和空白对照组,每组30只。三组均行中度颅脑损伤打击,创伤后24小时内,给予EPCs组鼠尾静脉移植血管内皮祖细胞,抑制血管生成组给予局部及鼠尾静脉注射VEGF抗体,空白对照组鼠尾静脉注射等量细胞培养液,无菌饲料喂养。 3.神经系统评分：每组大鼠每日按改良大鼠神经功能评分(：mNSS)评定大鼠神经系统损伤及恢复程度。 4.脑水肿程度评估：于第3日、第7日、第14日随机数字法从三组大鼠中分别抽取10只,麻醉后升主动脉灌注生理盐水100ml,断头取脑,脑组织称重,后放入50%蔗糖溶液脱水沉底,再次称重,二者相减计算出脑组织含水量。 5.血管新生程度观察：将脱水后的脑组织放入4%多聚甲醛中固定过夜,于创伤区做连续石蜡切片,免疫组化CD34+,CD133+染色,镜下计数阳性细胞,观察创伤区内皮血管祖细胞聚集以及血管新生情况。 6.数据分析：将mNSS评分所得分数、脑组织水肿数据,镜下阳性细胞计数数据输入统计分析软件,判断其相关性及是否有统计学意义。 结果： 在脑组织含水量的测定中,EPCs组脑组织平均含水量为(77.26±2.24)%,血管抑制组的脑组织平均含水量为(76.71±1.85)%,空白对照组的脑组织平均含水量为(75.48±1.92)%,三组数据差异运用单因素方差分析,LSD检验无明显统计学意义(取P0.05为有统计学意义)。在神经系统功能损伤评分中,EPCs组得分明显高于其他两组,而血管抑制组和空白对照组得分差异并无明显统计学意义。而在CD34+及CD133+免疫组化染色中,EPCs组镜下计数的阳性细胞远多于其他两组,而统计学分析,镜下阳性细胞的数量与预后评分呈正相关,与脑组织含水量无明显相关性。 结论： 1.移植外源性EPCs不会明显加重创伤脑组织的水肿程度。 2.移植外源性EPCs可明显增加创伤脑组织新生血管数量,并促进神经再生。 3.移植外源性EPCs可显著改善脑损伤大鼠预后。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R651.15

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本文编号：2375400