维生素D结合蛋白对脓毒症继发多器官功能不全的作用机制研究

发布时间：2018-12-15 00:47

【摘要】：目的：本实验旨在探讨维生素D结合蛋白(VDBP)及维生素D相关代谢物在评估脓毒症预后的价值,并进一步在脓毒症动物模型及体外细胞实验水平验证维生素D结合蛋白在脓毒症继发多器官功能不全的作用机制。方法：(1)收集我院2013-2015年重症监护病房(外科、呼吸科及急诊科)住院的脓毒症患者(满足脓毒症诊断标准sepsis 2.0)的临床资料。应用ELISA分别检测78例脓毒症组和50例健康对照组血清VDBP.25(OH)D3、1,25(OH)2D3及IL-6水平。记录患者的生命体征、血常规、血生化、PCT、CRP、凝血功能等资料。比较不同预后脓毒症患者VDBP及维生素D相关代谢物和其他临床相关指标的差异以及相关性。(2)应用盲肠结扎穿孔法(CLP)构建小鼠脓毒症模型,收集小鼠术后1d、3d、5d、7d的血清、尿液以及肝脏、肺脏、肾脏、脾脏等组织,应用ELISA检测小鼠血清及尿液VDBP水平,HE染色比较病理损伤程度,VDBP免疫组化方法比较VDBP的器官分布,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)知western-blot方法比较不同手术组间VDBP的mRNA和蛋白表达差异与凋亡蛋白caspase3的相关性。(3)应用qRT-PCR知western-blot方法比较不同浓度LPS(0ng/ml,10ng/ml、100ng/ml、 1ug/ml、10ug/ml)和不同诱导时间(Oh、6h、12h、24h和48h)对HepG2肝细胞系合成VDBP的影响,以及与凋亡、增殖的相关性；构建稳转过表达及敲减VDBP的RAW264.7巨噬细胞株,应用流式细胞术比较VDBP不同表达水平对LPS(1ug/ml)诱导巨噬细胞凋亡的影响,应用qRT-PCR知western-blot探讨VDBP调控LPS介导的巨噬细胞凋亡相关caspase、MAPK、NF-κB通路。结果：(1)脓毒症死亡组年龄、尿素氮、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分显著高于生存组,血清25 (OH) D3、1,25 (OH) 2D3及VDBP水平显著低于生存组。年龄是脓毒症患者死亡的独立危险因素,25(OH)D3是独立保护性因素。VDBP与肝功能(ALB、TP)及凝血指标(PA、FIB)具有较好的相关性(P0.05)。(2)脓毒症小鼠血清VDBP水平低于假手术组,以术后第5天水平最低,与假手术组相比差异有统计学意义。脓毒症小鼠尿液VDBP水平低于假手术组,差异有统计学意义；且尿液VDBP水平与血液VDBP水平呈正相关。脓毒症状态下,小鼠出现肝脏、肺脏、脾脏、肾脏等多脏器损伤,CLP组各损伤器官的炎细胞浸润部位VDBP免疫组化灰度值显著高于假手术组,VDBP血清水平与组织损伤程度呈负相关。脓毒症状态下,肝脏合成VDBP能力下降,与肝组织损伤及凋亡相关。(3)随着LPS诱导时间延长及浓度的增加，，HepG2肝细胞合成VDBP水平及细胞增殖能力下降,凋亡增加。VDBP稳转过表达组与敲减组相比,LPS诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡比例显著增加,与Caspase(caspase-3,caspase-8, caspase-9知caspase-12)通路、MAPK(P-P38,P-JNK,P-ERK)通路及NF-κB(P-NF-κB)通路相关。结论：(1)25 (OH) D3、1,25 (OH) 2D3及VDBP水平对脓毒症的预后具有预警价值,其中25(OH)D3是独立保护性因素；VDBP与肝功能及凝血指标具有较好的相关性,可以对脓毒症患者肝功能损伤及凝血障碍早期预测。(2)脓毒症状态下,血清及尿液VDBP水平可以间接反映肝脏合成障碍及肺脏、脾脏等组织的损伤程度。(3)LPS可通过影响经典凋亡通路干预肝细胞合成VDBP的能力；VDBP可通过Caspase通路、MAPK通路及NF-κB通路介导LPS刺激的巨噬细胞凋亡。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7

【参考文献】