重组人FcγRI核酸适配子的体外筛选及其在脓毒血症实验诊断中的应用研究

发布时间：2019-11-09 05:57

【摘要】：【研究目的】以重组人FcγRI胞外段蛋白作为靶分子,应用指数富集配基的系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技术,从体外合成组合化学的96 nt随机ss DNA核酸文库中筛选出人FcγRI高亲和力和高特异性的适配子,用人FcγRI特异性核酸适配子建立初步的、应用于脓毒血症实验诊断的新方法。【方法】1.体外化学合成96 nt随机ss DNA核酸文库,文库中核酸序列的两端均为18 nt固定的引物序列,中间为60 nt的随机序列,以重组人FcγRI蛋白片段为靶标,应用SELEX技术筛选针对人FcγRI高亲和力和特异性的核酸适配子,用荧光标记法检测ss DNA富集文库与人FcγRI的结合力;2.将第7、8轮筛选PCR产物TA克隆、测序,采用相关软件对测序的单克隆核酸适配子进行生物信息学分析;3.挑选人FcγRI单克隆核酸适配子,使用流式细胞仪和荧光显微镜测定其亲和力、灵敏度和特异性。【结果】1.荧光定量分析显示,第6轮筛选ss DNA富集库与人FcγRI结合力达到峰值,ss DNA富集库与该靶标的结合位点达到饱和状态;2.结合Clustal X 1.83、Mega 5和RNAstructure 5.6分别将第7、8轮单克隆适配子分成7和5个家族;第7轮筛选的33条核酸适配子中有三对完全一致的富集序列;RNAstructure 5.6模拟的核酸适配子的二级结构主要以茎-环和G-四聚体结构为主;3.流式细胞分析结合软件计算适配子LW7-1、LW7-9与LW7-27的亲和力分别为12.76 n M、14.03 n M、6.676 n M,Kd值均达到纳摩尔水平,适配子检测细胞数可低至2×106个;4.流式细胞仪分析结果显示,LW7-1、LW7-9和LW7-27与脓毒血症中性粒细胞结合的荧光强度明显比阴性对照和正常对照强,说明这三条适配子是针对中性粒细胞表面的FcγRI蛋白的;5.荧光显微镜分析显示,三条适配子均能够单独或协同检测脓毒血症中性粒细胞,LW7-9所染细胞荧光强度最强,是我们后续研究的重点,荧光标记适配子直接检测法(FLADA)也是我们建立的初步的、由荧光显微镜检查的、有望实现脓毒血症鉴别诊断的新方法。【结论】本研究运用SELEX技术经过8轮筛选,获取针对人重组FcγRI胞外段蛋白特异性ss DNA核酸适配子,我们对部分核酸适配子进行了亲和力、灵敏度和特异性分析,建立了初步的、由荧光显微镜检查的、有望实现脓毒血症鉴别诊断的FLADA法,为建立定量或半定量的床边检测(Point Of Care Testing,POCT)方法奠定了基础。
【图文】：

核酸,化学修饰,位点

核酸适配子也可通过连接药物分子、纳米颗粒、病毒载体、脂质体、聚乙二醇等用于临床治疗。图2 核酸适配子常见的化学修饰位点Figure 2 Common chemical modified epitopes of aptamers7. 无毒性、免疫原性小，组织穿透性好：这是适配子作为药物或体内定位和检查的最突出的优势。上述这些特性说明，适配子可作为一种新的分子探针应用于分子医学研究，，核酸适配子目前在国内外被广泛应用于基础研究和应用研究。主要包括：1.蛋白质与核酸的作用机制，主要用于研究疾病发生、发展的分子机制；2.获取高效、特异性的靶蛋白抑制剂，用于蛋白质功能研究和新药研制等；3.在实验诊断方面，核酸适配子作为检测分子，正在取代或联合抗体被广泛应用于ELISA法、荧光原位杂交、Westernblotting、芯片技术、流式细胞技术、荧光偏振、毛细管电泳和芯片技术等方面，用于检测不同生物分子

示意图,亲和介质,磁珠,蛋白S

图 3 以磁珠为亲和介质的蛋白 SELEX 筛选示意图[25]igure 3 Schematic representation of SELEX for protein immobilized on magnetic beads二、实验结果
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7

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