HMGB1联合MSCs移植对急性心肌梗死大鼠心脏功能影响的实验研究

发布时间：2020-06-16 04:37

【摘要】：目的：本课题组前期研究已证实骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）移植治疗能够促进心肌梗死后梗死交界区域微血管生成，改善心肌梗死后的心功能。然而，由于移植MSCs在心肌梗死区存活率低，以及心梗区炎症反应，使得大量的移植细胞快速凋亡等诸多问题，大大降低其治疗效果。近年研究显示高迁移率组蛋白1（High Mobility Group Box-1，HMGB1）可以通过调节损伤组织的促进血管生成相关因子和炎症因子的表达，可能进一步刺激干细胞的增殖、分化和旁分泌效应，而参与组织的损伤修复。因此，本研究拟在大鼠急性心肌梗死的模型上，通过注射HMGB1及拮抗HMGB1表达，同时联合移植MSCs，观察HMGB1联合MSCs移植是否能进一步改善梗死区域局部微环境、增强干细胞的旁分泌效应，以期更好地发挥干细胞修复心肌的作用。方法：通过贴壁离心法培养获得高纯度大鼠MSCs；进行细胞表型鉴定；SD雄性大鼠共144只，随机分为六组：正常对照组、模型对照组、MSCs移植组、HMGB1注射组、HMGB1注射+MSCs移植组、HMGB1BoxA注射+MSCs移植组(n=24只)。制备大鼠急性心肌梗死模型，按照造模成功后心肌内注射1.0×106个MSCs、结扎冠脉左前降支前后腹膜内各注射1次100ng HMGB1（10μg/ml）、MSCs移植联合HMGB1注射、MSCs移植同时腹膜内注射HMGB1BoxA400μg给药方法分别处理。术后3天，7天，28天ELISA法检测血清TLR4、VEGF、IL-6、NF-b、TNF-α、HMGB1浓度水平。术后28天心脏彩超测定心脏功能，心脏切片染色观察病理改变，TTC染色测定心梗面积、梗死区新生血管免疫组化测定梗死区新生血管密度。结果： 1、心功能：术后28天各组行超声心动图检测LVDd、LVDs、FS和EF值，结果显示，与MSCs移植组、HMGB1注射组、HMGB1BoxA注射+MSCs移植组比较，HMGB1注射+MSCs移植组的心功能改善最为显著，LVDd和LVDs明显缩小，FS和EF值增加（P0.05）；余组心功能改善情况依次为：MSCs移植组＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植组＞HMGB1注射组＞模型对照组（P0.05）。 2、梗死面积测定：术后28天心肌TTC染色显示HMGB1注射+MSCs移植组的梗死面积较药物干预其它三组明显减小；余组梗死面积测定值依次为：模型对照组＞HMGB1注射组＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植组＞MSCs移植组（P0.05）； 3、心肌梗死区新生血管测定：HMGB1注射+MSCs移植组的CD31染色新生血管数较药物干预其它三组明显增多；余组新生血管测定值依次为：MSCs移植组＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植组＞HMGB1注射组＞模型对照组（P0.05）。 4、血清TLR4、VEGF及HMGB1水平：血清HMGB1测定值术后3天、7天时间点依次为：模型对照组＞MSCs移植组；血清TLR4、VEGF测定值术后3天时间点依次为：HMGB1注射+MSCs移植组＞MSCs移植组＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植组＞HMGB1注射组＞模型对照组，术后7天时间点依次为：HMGB1注射+MSCs移植组＞MSCs移植组＞HMGB1注射组＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植组＞模型对照组；28天时间点上TLR4、VEGF及HMGB1各浓度水平各组无统计学差异（P0.05）。 5、血清IL-6、NF-b及TNF-α水平：血清IL-6、NF-b及TNF-α测定值术后3天时间点依次为：HMGB1注射组＞模型对照组＞HMGB1注射+MSCs移植组＞MSCs移植组＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植组，术后7天时间点依次为：模型对照组＞HMGB1注射组＞MSCs移植组＞HMGB1BoxA注射+MSCs移植组＞HMGB1注射+MSCs移植组，28天时间点上IL-6、NF-b及TNF-α各浓度水平各组无统计学差异（P0.05）。结论： HMGB1联合MSCs移植治疗比较单MSCs移植治疗及单HMGB1注射治疗对梗死心肌局部促进血管生成因子的表达增加，炎症因子的表达减少。从而对大鼠急性心肌梗死后心功能改善、心肌梗死面积减少和局部新生血管生成等更为有益，而拮抗HMGB1后上述作用明显削弱。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R542.22
【图文】：

原代培养,细胞,第二代,多角形

2.1 MSCs 的培养、鉴定、标记2.1.1 MSCs 的培养原代培养过程中观察可见密集圆形细胞，含各种骨髓原始细胞。第 3 天换液，可见部分细胞贴壁，可见有少量细胞由圆形变为多角形或短棒状，呈集落状分布；第4~6 天，可见多角形或短棒状的细胞逐渐增多，细胞体积增大，可观察到分化完整细胞器，并逐渐扩散、相互交联；至 7 天左右，全部细胞均为梭形，且呈涡流状，排列细胞部分融合，可铺满瓶底达 80%-90%。细胞传至第 3 代时，倒置显微镜下可见细胞形态逐渐均匀生长成为梭形，形态趋于一致，且分布均匀。细胞的增殖速度较原代明显增快，当细胞传代至 4 代以后，细胞生长趋于缓慢，形态有衰老趋势（图 1）。2 实验结果

流式细胞仪分析,流式细胞术,视野计,蓝色荧光

22图 2 流式细胞术鉴定 MSCs 流式细胞仪分析显示多数 MSCs 细胞表达 CD29 和 CD90，极少数细胞表达 CD45Figure 2 Surface antigen of MSCs measured by Flow Cytometry, and MSCs expressing CD90 andCD29, little expressing CD452.1.3 DAPI 标记 MSCs选用第 3 代生长状态良好的 MSCs 细胞，予 DAPI 染色，观察到 MSCs 细胞染色成功，细胞核蓝色荧光表现。400 倍高倍镜下随机选取 3 个高倍视野计数，以镜下平均数计算标记率为 94%（图 3）。

【参考文献】