细胞色素P450表氧化酶2J2及其代谢产物EETs对细菌脂多糖诱导的急性肺损伤时血管渗透性的影响及其机制研究
发布时间：2020-07-01 09:59
【摘要】：研究背景和目的：急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是各种致病因素损伤肺泡上皮细胞及微血管内皮细胞,细胞间连接遭受破坏,所造成的以弥漫性间质性肺水肿为主要病理特征,以急性低氧性呼吸功能不全为主要临床特征的综合征,是老年住院患者主要的死亡原因之一。尽管我们普遍认为脓毒血症的病理过程涉及多种炎性细胞的激活、炎性介质的释放以及凝血因子的活化,但最终最直接的死亡原因是其导致的急性肺损伤引起的呼吸窘迫,目前除了机械通气以外,临床尚没有有效的治疗手段,其根本原因是我们对其发病机制缺乏充分的认识。开发出针对脓毒血症性肺损伤的新型有效的治疗方式需要我们对其进行深入的探索和研究。内皮屏障的完整性是脓毒血症急性肺损伤预后的决定性因素,因此改善脓毒血症性肺损伤预后的关键在于维持内皮屏障的稳定性。血管内皮钙黏蛋白VE-cadherin (vascular endothelial cadherin)是内皮细胞与细胞间粘着连接(adherent junction)的主要结构基础,它是一种跨膜受体,其胞外区域与邻近细胞的VE-cadherin相结合,胞内区域通过一系列肌动蛋白结合蛋白((a, β, y and p120 catenins)铆定到细胞骨架MLC(myosin light chain, MLC)上。VE-cadherin的磷酸化和内化,细胞骨架MLC重排产生应力纤维诱导的向心力,最终使相邻细胞分开是增加细胞间渗透性的基本方式。任何能够抑制VE-cadherin以及MLC磷酸化的分子都能够减轻炎症介质诱导的血管渗透性增加。表氧化二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic Acid,EETs)是花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)的细胞色素P450表氧化酶(CYP450)代谢产物,其在多种病理状态中均表现出血管保护作用,但关于其是否能增强血管内皮屏障功能及其可能的分子生物学机制尚不得而知。之前关于脓毒血症性肺损伤时肺组织中的炎细胞浸润以及液体渗出情况的研究,大多数将焦点集中在炎症或者炎细胞本身生物学特性的改变,而少有从内皮细胞的角度探索炎细胞浸润的分子机制,而本研究主要是为了探索细胞色素P450表氧化酶2J2(CYP2J2)系统对血管渗透性的影响及其机制。研究方法：在动物实验部分,选取8-12周的雄性CYP2J2过表达以及周龄相匹配的同窝野生型小鼠,随机分成四组：野生组(WT,给予生理盐水腹腔注射)、LPS组(给予细菌脂多糖LPS 10mg/kg腹腔注射)、CYP2J2组(给予生理盐水腹腔注射)、CYP2J2+LPS(给LPS10mg/kg腹腔注射)；除了使用转基因鼠以外,我们还使用EET代谢酶sEH的抑制剂TPPU给小鼠灌胃以进一步证实CYP2J2系统对LPS诱导的血管渗透性的影响。在细菌脂多糖LPS处理后6小时：部分小鼠通过尾静脉以2mg/100g的浓度注射伊文思蓝(Evans blue)染液,1小时之后,通过右心室灌洗清除血管内残留的伊文思蓝,然后取出肺拍照、匀浆经甲酰胺处理后测OD值；部分小鼠行支气管肺泡灌洗,收集灌洗液,离心后取上清检测总蛋白浓度以及相关炎症因子的表达；部分小鼠取出肺组织,或制备石蜡切片,或于-80冻存以备后续的髓过氧化物酶(MPO)活性检测以及western检测。在细胞实验部分,我们使用LPS诱导脐静脉内皮细胞-细胞间发生结构改变,使用sEH抑制剂AUDA来预处理以观察AUDA诱导的内源性EETs增加对LPS诱导的内皮细胞间连接成分改变的作用及其具体的可能的分子生物学机制。一：探讨CYP2J2在内皮细胞中特异性高表达以及sEH抑制剂TPPU对小鼠脓毒血症性急性肺损伤时血管渗透性的作用1.观察腹腔注射LPS后120小时内死亡率,绘制生存曲线2.HE染色：观察肺间质炎细胞浸润情况3.MPO免疫组化：观察肺间质中性粒细胞的浸润情况4.MPO活性检测：肺间质中性粒细胞的浸润情况5.伊文思兰染色和肺泡灌洗液的蛋白浓度测定：检测蛋白的跨血管渗出情况6.肺湿重干重比：检测血浆液体的跨血管渗出情况7. 免疫荧光：NG2、CD31免疫荧光染色观察血管周细胞的数量二、sEH抑制剂AUDA对内皮连接成分的作用其机制1. FITC-右旋糖苷transwell:检测AUDA对LPS诱导的内皮细胞单层渗透性增加的调节作用2. Western blot:检测VE-cadherin的可溶成分和不可溶成分的转换3. Western blot:检测VE-cadherin和MLC的磷酸化修饰4.流式细胞术：检测对LPS对内皮细胞凋亡的作用三、AUDA调节内皮渗透性的机制探索1. ROCK在AUDA调节内皮渗透性中的作用2.氧化应激在AUDA调节ROCK介导的渗透性变化中的作用3.Src激酶在AUDA调节内皮渗透性中的作用4.Src激酶对LPS诱导的氧化应激的作用研究结果：一、CYP2J2在内皮细胞中特异性高表达缓解了小鼠脓毒血症性急性肺损伤时血管渗透性的增加1. CYP2J2内皮细胞特异性高表达降低了LPS脓毒血症所致的死亡率2. CYP2J2内皮细胞特异性高表达降低了脓毒血症性急性肺损伤所致的肺间质中炎细胞尤其是中性粒细胞的浸润3. CYP2J2内皮特异性高表达降低了脓毒血症性急性肺损伤所致的肺间质液体渗出4. CYP2J2内皮特异性该表达降低了脓毒血症性急性肺损伤所致的肺泡腔蛋白的渗出5. CYP2J2内皮特异性该表达抑制了脓毒血症性急性肺损伤所致的血管周细胞的丢失6.sEH抑制剂TPPU抑制了小鼠急性肺损伤时的血管渗透性增加二、 sEH抑制剂AUDA对内皮连接成分的作用其机制1. AUDA减少了LPS所致的FITC标记的右旋糖酐的跨内皮渗出2. AUDA减少了LPS所致的VE-cadherin由不可溶形式向可溶形式的转化3. AUDA减少了LPS所致的细胞连接成分的磷酸化修饰4. 以上AUDA对内皮屏障的维持作用并不是由减少细胞凋亡来实现的三、AUDA调节内皮渗透性的机制探索1. AUDA是通过Rho-ROCK来调节内皮渗透性的1) AUDA减少了LPS诱导的Rho活性增加2) AUDA减少了LPS诱导的Rho下游分子ROCK活性的增加,即减少了nypt(肌球蛋白磷酸酶)的磷酸化2. AUDA是通过调节ROS生成来调节Rho-ROCK介导的内皮渗透性改变的1)氧化应激清除剂NAC减少了LPS诱导的ROS生成,缓解了LPS诱导的内皮渗透性增加2)氧化应激清除剂NAC可以缓解LPS诱导的Rho-ROCK活化3) AUDA可以减少LPS诱导的ROS生成以及NOX2表达,与NAC作用相似4) AUDA缓解了H202直接诱导的渗透性改变,与NAC作用相似3. AUDA是通过调节GRP78与Src结合触发的Src活化来调节内皮渗透性的1) AUDA减少了GRP78与Src的结合以及Src的活化2)Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导的内皮渗透性增加3)Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导的细胞连接成分(VE-cadherin)以及细胞骨架成分(MLC)的磷酸化4.GRP78与Src结合触发的Src活化作用于ROS上游1)Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导ROS生成2)Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导NOX2表达3)Src抑制剂PP1缓解了LPS诱导ROCK活化结论：一、CYP2J2可以降低脓毒血症性肺损伤,降低死亡率,抑制脓毒血症性急性肺损伤所致的血管渗透性增加二、 CYP2J2可以减少细胞粘着连接成分VE-cadherin的磷酸化,以及细胞骨架MLC的磷酸化,从而减少细胞连接的开放三、 CYP2J2稳定内皮细胞间粘着连接的作用是通过抑制GRP78介导的Src活化,减少ROS生成,从而降低Rho-ROCK通路的活化来实现的关于AUDA如何调控GRP78与Src相互作用的机制,待后期实验进一步探讨。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.8
【图文】：
存曲线的测定时，我们给予小鼠１５ｍｇ／ｋｇ的细菌脂多糖化ＰＳ）腹腔注射，随后继续饲逡逑养于ＳＰＦ级动物房并给予正常食水，每２４小时观察一次，持续观察记录１２０小时。逡逑如图２所示，第２４小时时，ＬＰＳ组的生存率为５０％，而Ｔｉｅ２Ｊ２过表达组的生存率为逡逑１００％；邋４８小时时ＬＰＳ组的生存率为２０％，而Ｔｉｅ２Ｊ２组小鼠的生存率为１００％；之后逡逑便不再有小鼠死亡。从生存曲线来看，内皮特异性的２Ｊ２过表达显著降低了腺毒血症逡逑所致的死亡率。逡逑ｔ巧１逦＊逡逑２Ｊ２邋一三二■一一－？＾邋Ｉ邋仙－逦ｒ－ｈ逡逑Ｓ邋３０－逦ｉ逡逑Ｔｕｂｕｌｉｎ逦乏劝－逡逑分＾处邋＾邋巧。１１邋■邋１１邋，邋ＩＩ．，邋Ｉ邋Ｍ逡逑咬逦全邋《邋冷邋卢逡逑户々？々／逡逑困１：左图为ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＣＹＰ２Ｊ２蛋白质在小鼠肺组织中的表达．右困为ＥＬＩＳＡ法测定血浆中逡逑１４，１５－ＥＥＴ的生成。与野生组相比较，Ｔｉｅ２Ｊ２转基因组ＣＹＰ２Ｊ２表达显著增加．１４．邋１５－ＥＥＴ明显升苗．逡逑ＷＴ为野生型未予ＬＰＳ处理纪，ＷＴ＋ＬＰＳ为巧生型ＬＰＳ处理纪，Ｔｉｅ２Ｊ２为过表达未予ＬＰＳ处理组，逡逑Ｔｉｅ２Ｊ２＋ＬＰＳ为过表达ＬＰＳ处理组．逡逑２８逡逑
在发腺霉血殖性帅损伤时，各种导致血管n蛲感訶椉拥乃鹕艘蛩厥鼓谄は赴溴义狭悠苹担赴浞煜对黾樱褐性黾拥难紫赴ㄖ饕侵行粤Ｏ赴┩ü鹕说腻义夏谄ぜ湎肚ㄒ频剿ё橹渲省Ｈ缤迹乘荆樱龋湃旧慕峁纯矗喽杂谏韞U水逡逑处理的小鼠而言，ＬＰＳ增加了肺间质中的炎细胞浸润，但Qg皮特异性２Ｊ２离表达却降逡逑低了邋ＬＰＳ诱导的肺组织间质炎细胞的聚集；从ＭＰＯ免疫组化（图４）邋＾心及ＭＰＯ活性逡逑检规（图５）的结果O喛矗颐堑玫酵慕崧郏喽杂谏硌嗡淼男∈螅蹋校覺楀义霞恿朔巫橹停校系谋泶铮何从瑁蹋校痈骨蛔⑸浯淼哪谄ぬ匾煨裕玻剩瞶┍泶镄∈螅溴义希停校媳泶锵喽杂谖从瑁蹋校哟淼囊吧托∈笪廾飨圆畋穑欢玻剩采瘫泶锏模蹋校哟礤义系男∈笃洌停校媳泶锉纫吧停蹋校幼榈停得髂谄ぬ匾煨裕玻剩补泶锝档土隋澹蹋校佑盏煎义系模停校媳泶镌黾樱崾荆蹋校釉黾恿讼俣狙⑹狈渭渲手行粤Ｏ赴男罨谄ぬ劐义弦煨裕玻剩瞶┍泶锛跎倭隋澹蹋校佑盏嫉乃Ъ渲手行粤Ｏ赴罨＃咨辖峁崾灸谄ぬ匾煨藻义希玻剩补泶锛跎倭酥行粤Ｏ赴目缙琳锨ㄒ
本文编号：2736611
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.8
【图文】：
存曲线的测定时，我们给予小鼠１５ｍｇ／ｋｇ的细菌脂多糖化ＰＳ）腹腔注射，随后继续饲逡逑养于ＳＰＦ级动物房并给予正常食水，每２４小时观察一次，持续观察记录１２０小时。逡逑如图２所示，第２４小时时，ＬＰＳ组的生存率为５０％，而Ｔｉｅ２Ｊ２过表达组的生存率为逡逑１００％；邋４８小时时ＬＰＳ组的生存率为２０％，而Ｔｉｅ２Ｊ２组小鼠的生存率为１００％；之后逡逑便不再有小鼠死亡。从生存曲线来看，内皮特异性的２Ｊ２过表达显著降低了腺毒血症逡逑所致的死亡率。逡逑ｔ巧１逦＊逡逑２Ｊ２邋一三二■一一－？＾邋Ｉ邋仙－逦ｒ－ｈ逡逑Ｓ邋３０－逦ｉ逡逑Ｔｕｂｕｌｉｎ逦乏劝－逡逑分＾处邋＾邋巧。１１邋■邋１１邋，邋ＩＩ．，邋Ｉ邋Ｍ逡逑咬逦全邋《邋冷邋卢逡逑户々？々／逡逑困１：左图为ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＣＹＰ２Ｊ２蛋白质在小鼠肺组织中的表达．右困为ＥＬＩＳＡ法测定血浆中逡逑１４，１５－ＥＥＴ的生成。与野生组相比较，Ｔｉｅ２Ｊ２转基因组ＣＹＰ２Ｊ２表达显著增加．１４．邋１５－ＥＥＴ明显升苗．逡逑ＷＴ为野生型未予ＬＰＳ处理纪，ＷＴ＋ＬＰＳ为巧生型ＬＰＳ处理纪，Ｔｉｅ２Ｊ２为过表达未予ＬＰＳ处理组，逡逑Ｔｉｅ２Ｊ２＋ＬＰＳ为过表达ＬＰＳ处理组．逡逑２８逡逑
在发腺霉血殖性帅损伤时，各种导致血管n蛲感訶椉拥乃鹕艘蛩厥鼓谄は赴溴义狭悠苹担赴浞煜对黾樱褐性黾拥难紫赴ㄖ饕侵行粤Ｏ赴┩ü鹕说腻义夏谄ぜ湎肚ㄒ频剿ё橹渲省Ｈ缤迹乘荆樱龋湃旧慕峁纯矗喽杂谏韞U水逡逑处理的小鼠而言，ＬＰＳ增加了肺间质中的炎细胞浸润，但Qg皮特异性２Ｊ２离表达却降逡逑低了邋ＬＰＳ诱导的肺组织间质炎细胞的聚集；从ＭＰＯ免疫组化（图４）邋＾心及ＭＰＯ活性逡逑检规（图５）的结果O喛矗颐堑玫酵慕崧郏喽杂谏硌嗡淼男∈螅蹋校覺楀义霞恿朔巫橹停校系谋泶铮何从瑁蹋校痈骨蛔⑸浯淼哪谄ぬ匾煨裕玻剩瞶┍泶镄∈螅溴义希停校媳泶锵喽杂谖从瑁蹋校哟淼囊吧托∈笪廾飨圆畋穑欢玻剩采瘫泶锏模蹋校哟礤义系男∈笃洌停校媳泶锉纫吧停蹋校幼榈停得髂谄ぬ匾煨裕玻剩补泶锝档土隋澹蹋校佑盏煎义系模停校媳泶镌黾樱崾荆蹋校釉黾恿讼俣狙⑹狈渭渲手行粤Ｏ赴男罨谄ぬ劐义弦煨裕玻剩瞶┍泶锛跎倭隋澹蹋校佑盏嫉乃Ъ渲手行粤Ｏ赴罨＃咨辖峁崾灸谄ぬ匾煨藻义希玻剩补泶锛跎倭酥行粤Ｏ赴目缙琳锨ㄒ
本文编号：2736611
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