TLR4介导小胶质细胞极化状态对创伤性脑损伤远期认知障碍的影响及机制研究

发布时间：2020-07-26 23:14

【摘要】：研究目的:创伤性脑损伤(TBI)是全世界重要的公共卫生问题,其所致的继发性损伤促进认知障碍的发生发展。小胶质细胞是中枢神经系统常驻的免疫细胞,是对抗疾病或损伤的第一道防线,其激活后的极化状态决定了继发性损伤和神经保护作用。因此,干预小胶质细胞极化状态可能是改善TBI远期认知障碍的关键靶点。TLRs是介导先天免疫的受体家族,特别是TLR4被认为是小胶质细胞活化的主要调节因子。TLR4在小胶质细胞中高度表达,在调节TBI后慢性炎症反应和启动继发性损伤中发挥至关重要的作用。我所在研究团队前期实验发现TBI慢性期脑组织中小胶质细胞以M1型为主,促进神经炎症,引发认知障碍。本课题将进一步阐明TLR4在调节小胶质细胞极化表型,改善TBI远期认知障碍的作用及机制,为TBI治疗新方法提供理论依据。研究内容与方法:1.通过免疫荧光及Western Blot检测TLR4,验证TAK242(TLR4抑制剂)可以有效抑制TLR4的表达;通过改良神经功能评分及Morris水迷宫实验,评价TLR4的表达对rmTBI小鼠神经功能及远期空间学习记忆的影响。2.应用Western Blot检测APP、p-Tau蛋白,评价TLR4对rmTBI小鼠病理性蛋白表达的影响。3.借助免疫荧光及Western Blot技术在体内体外实验中检测M1型小胶质细胞及M2型小胶质细胞表达情况及定量分析;应用ELISA技术检测炎症因子;探讨TLR4对rmTBI后急慢性期小胶质细胞极化表型及炎症因子释放的影响。4.体内体外实验,应用免疫荧光及Western Blot技术检测TLR4及下游蛋白Myd88、NF-κB的表达变化,明确TLR4及重要下游信号分子Myd88、NF-κB是否参与调控TBI后小胶质细胞极化表型及神经炎症反应。结果:1.(1)rmTBI急慢性期均出现TLR4表达升高,TAK242可以有效的抑制TLR4的表达。(2)rmTBI后急性期小鼠出现明显神经功能缺损,随着损伤时间延长,神经功能缺损逐渐恢复;在rmTBI后慢性期出现明显学习记忆能力下降;进一步验证了rmTBI是神经退行性疾病的重要危险因素。(3)rmTBI后,抑制TLR4的表达可以促进rmTBI小鼠神经功能缺损修复。(4)rmTBI后,抑制TLR4的表达可以改善rmTBI小鼠慢性期空间学习记忆能力。2.(1)rmTBI后3d即出现病理性蛋白APP,p-Tau蛋白表达增加,随着损伤时间延长至28d(慢性期),APP,p-Tau蛋白表达增加更为显著。(2)在rmTBI后的急慢性期,抑制TLR4的表达可减少病理性蛋白APP及p-Tau蛋白的表达。3.(1)体外实验证实:LPS激活小胶质细胞,促进小胶质细胞向M1型极化,促炎因子释放增加,抑炎因子释放减少;抑制TLR4的表达可促进小胶质细胞向M2型极化,抑炎因子释放增加,促炎因子释放减少。(2)体内实验证实:rmTBI后小胶质细胞激活,急性期M1,M2表达均有明显增高,炎症因子表达失衡;进入慢性期,M1型小胶质细胞仍持续激活,促炎因子释放增加,促进病理性蛋白累积,引起rmTBI远期认知障碍。在rmTBI急慢性期,抑制TLR4表达可使M1/M2比例显著下降,促进活化的小胶质细胞向M2型极化,增加抑炎因子释放,减少病理性蛋白的表达,最终改善认知功能。4.(1)通过免疫荧光双标记TLR4及小胶质细胞标志物Iba1,发现rmTBI后急慢性期较多的TLR4共定位于小胶质细胞,而假手术组仅有较少的TLR4共定位于小胶质细胞;TAK242干预后,较PBS组共定位于小胶质细胞的TLR4显著减少。(2)LPS损伤与rmTBI后,TLR4及下游信号分子蛋白Myd88、NF-κB的表达均显著升高,予TAK242干预后,TLR4及下游信号分子蛋白Myd88、NF-κB的表达较PBS组有显著下降,提示TLR4及下游信号因子Myd88、NF-κB参与调控rmTBI后的小胶质细胞极化及神经炎症反应。结论:1.TBI后,抑制TLR4表达可下调其下游信号分子Myd88、NF-κB的表达水平,降低小胶质细胞M1/M2比例,促进小胶质细胞向M2型极化;其次,抑制TLR4表达可促进抑炎因子释放,抑制慢性期神经炎症反应,减轻继发性脑损伤,从而导致病理性蛋白APP,p-Tau蛋白表达减少,最终改善TBI远期认知障碍。2.TLR4是调节小胶质细胞活化表型的重要模式识别受体,影响神经炎症的进展以及神经变性的发生发展。因此TLR4可能是改善TBI远期认知障碍的有希望的干预靶点。3.TAK242是潜在的TBI治疗新策略。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R651.15
【图文】：

病理,进程,神经退行性疾病,流行病学研究

2016 年 Nguye[1]等人对世界各国 TBI 发生率进行综述，研究显示全球 TBI 的年发生率为每年 349/10 万人。TBI 发生率高，其致残致死率居创伤之首，是全世界的重要公共卫生问题[2, 3]，普遍流行于高收入和中低收入国家并影响着所有年龄段人群。TBI 无论严重程度如何，都涉及大脑内一系列复杂的病理变化，包括神经毒性，代谢失衡以及离子和细胞稳态的一般破坏[4]。TBI 病理过程包括两方面：①原发性病理改变：脑血管病变和弥漫性轴索损伤；②继发性病理改变：主要为神经炎症、低氧血症、细胞凋亡坏死、脑水肿等（图 1）。目前，越来越多的流行病学研究发现，TBI 可增加神经退行性疾病如阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病、帕金森病等的发病率[5]。同时越来越多的证据表明反复轻度 TBI（repetitivemild Traumatic brain injury,rmTBI)可能导致短期和长期对神经功能的不利影响，与远期神经退行性疾病的发生存在紧密联系。一系列流行病学研究已将 TBI 列为神经认知综合征的重要危险因素。目前，TBI 后远期认知功能障碍是国际颅脑创伤领域新兴的一个研究热点，研究报道尚少，因此研究其病理机制及干预措施，具有重要临床意义！

小胶质细胞,极化状态,表型,认知障碍

击（CCI）后 1 周增加，而 CD86（+）/ CD11b（+）M1 表型小胶质细胞在 4 周时增加。在 TBI 的小鼠模型中，瞬时 M2 表型小胶质细胞是脑损伤急性期的活化小胶质细胞的初始表型，并且在损伤后 5 天达到峰值，但 M1 表型小胶质细胞保持升高直至 14 天[15]。在 CCI 后 1 年的小鼠模型中观察到，活化的小胶质细胞可以在受伤的皮质中持续表达，伴有病变扩张和神经变性[16]。在对 TBI 患者大脑 PET 扫描观察到小胶质细胞激活在创伤后可存在长达 17 年[17]。本人所在课题组同期研究也发现 TBI 后 M1 型小胶质细胞持续升高，而 M2 型小胶质细胞在损伤后 1 周达高峰，损伤后 4 周出现显著下降，在 TBI 慢性期，以 M1 型小胶质细胞为主，促炎因子释放增加，促进认知障碍的发生[18]。综上研究，TBI 后活化的小胶质细胞表型从急性激活的 M2表型转变为长期激活的 M1表型，在 CNS中产生较为持久的免疫炎症反应，引起内环境紊乱，促进神经变性的发生，从而导致远期认知障碍的发生发展（见图 2）。抑制 M1 型小胶质细胞，促进 M2型小胶质细胞可以改善TBI小鼠神经功能恢复[19]。因此，调节小胶质细胞M1/M2比例，减轻继发性脑损伤，是改善 TBI 远期认知障碍的重要靶点。

TLR4介导小胶质细胞极化状态对创伤性脑损伤远期认知障碍的影响及机制研究

CCI装置

【相似文献】