以胶原水凝胶为支架体外构建肝细胞三维共培养系统

发布时间：2017-04-17 10:20

  本文关键词：以胶原水凝胶为支架体外构建肝细胞三维共培养系统，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【背景】急性肝衰竭病程进展迅速，病死率高，肝移植被认为是唯一有效的治疗手段，但供肝严重缺乏。人工肝支持系统可有效替代急性肝衰竭患者的肝脏功能，为肝细胞再生及等待肝源提供时间，协助患者顺利度过肝衰期，最终降低肝衰竭患者死亡率。近年来，多种生物人工肝(BAL)相继被研发并在临床应用，因不仅具有解毒作用，还有肝细胞的合成、代谢功能，在肝衰竭治疗上显示出极大的优越性。但目前研发的BAL尚不能充分模拟体内肝脏微环境，肝细胞在体外培养及治疗过程中易失去活性及功能，严重影响治疗效果。因此，改善肝细胞培养体系，使BAL中肝细胞长期维持活性及功能是达到理想治疗效果的关键。胶原水凝胶支架因含水量高、氧气、营养物质及代谢废物容易运输、液固转换、生物相容性好、制作工艺简单以及易于交联可溶性生长因子等优点而广泛应用于细胞三维培养，前期结果也证实将肝细胞在胶原水凝胶中三维培养可显著延长其白蛋白及尿素分泌水平。而将肝细胞与其它细胞共培养也可显著促进肝功能维持。因此，本文联合三维培养、添加生长因子及共培养三种方式促进肝细胞功能维持，将肝细胞及NIH/3T3成纤维细胞接种于预混肝细胞生长因子(HGF)的胶原水凝胶中构建肝细胞三维共培养系统，并对此培养体系进行进一步优化及功能验证，为构建有效的BAL奠定基础。 【目的】联合使用胶原水凝胶、HGF及NIH/3T3成纤维细胞体外构建能够长时间有效维持肝细胞活性及功能的肝细胞三维共培养系统。 【方法】(1)将SD大鼠原代肝细胞及NIH/3T3成纤维细胞与预混HGF及DMEM的液态I型胶原混合构建肝细胞三维共培养系统，通过相差显微镜、HE染色、糖原(PAS)染色、免疫荧光染色等方法对培养肝细胞的形态、表型、白蛋白及糖原合成功能进行初步检测。(2)为进一步优化培养系统，在胶原水凝胶支架中分别混合五种不同比例的肝细胞与NIH/3T3成纤维细胞(H:F为1:0.5、1:1、1:2、1:4及1:8)、接种四种不同浓度的细胞混悬液(2×104/mL,2×105/mL,2×106/mL and2×107/ml)后连续培养25天，收集培养液上清，比较各组中肝细胞的白蛋白及尿素合成水平变化，筛选出最佳的培养条件，然后采用三种不同培养方式(单独培养，插入培养，共培养)进行培养，评估共培养细胞之间的直接接触作用或间接作用，从而确定最佳的培养方式。(3)使用最优化条件构建肝细胞三维共培养系统后连续培养肝细胞25天，在不同时间点通过LIVE/DEAD染色、WST-1试验检测细胞活性，并对肝细胞功能维持(白蛋白及尿素分泌、LDL摄取)、肝细胞特异基因表达水平等进行检测。 【结果】(1)肝细胞/胶原水凝胶复合物呈凝胶状悬浮培养于培养板中，相差显微镜下观察可见细胞呈圆形，以三维立体方式均匀分散在胶原水凝胶中；培养7天后，HE染色可见肝细胞聚集生长，成纤维细胞则围绕肝细胞生长，CK18染色阳性说明肝细胞未逆分化，仍保持成熟肝细胞表型，，并且PAS染色及白蛋白免疫荧光染色阳性，提示细胞仍具有糖原及白蛋白合成功能。(2)按照H:F为1:0.5、1:1、1:2、1:4及1:8接种，检测培养液上清中白蛋白及尿素分泌含量结果显示，培养后分泌水平逐渐上升，到第5或7天时达到高峰，后随培养时间延长逐渐下降，但H:F为1:0.5组在20天内白蛋白及尿素分泌含量仍分别维持在30-50μg/24h,40-110μg/24h的较高水平，与其它组相比有统计学差异(P0.05)；接种四种不同细胞密度后，细胞接种密度2×106/ml组白蛋白分泌及尿素合成能力最强，增加或减少细胞密度对肝细胞的功能没有明显作用，并且第7天的分泌含量与其余各组相比具有统计学意义(P0.05)；将细胞采用三种方式培养，在培养第3天，各组白蛋白与尿素分泌含量无明显差异，而在第7和第20天，共培养组的白蛋白分泌含量与单独培养组及插入培养组相比明显升高，第7天分别升高2.10及1.46倍，第20天分别升高4.58及1.75倍，尿素合成与白蛋白分泌趋势类似。(3)使用最优化条件培养肝细胞后，与单独培养组相比，共培养组细胞存活率显著升高(分别为52.25±4.62%及32.92±5.32%, P0.01,第20天)，白蛋白分泌、尿素合成及LDL摄取能力增强，肝细胞特异基因表达(Albumin, HNF-4α, Claudin-3及G6P)明显升高(P0.05)，并且肝药酶诱导效果显著，在诱导后CYP2E1表达明显升高，与单独培养相比结果有统计学差异，而CYP1A2, CYP2B2及CYP3A1在诱导后稳定表达，CYP1A1则下降。 【结论】以胶原水凝胶为支架成功构建了肝细胞三维共培养系统。按照肝细胞与成纤维细胞比例为1:0.5、细胞密度为2×106/ml在胶原水凝胶中接种细胞并采用共培养细胞直接接触的培养方式可最大程度发挥肝细胞功能，这些参数可以为制备BAL提供参考。这种肝细胞共培养并复合细胞外基质及生长因子的培养模式可以最大程度的模拟肝脏微环境，在结构上更类似肝脏组织，并能在更长时间内有效维持肝细胞活性以及合成代谢等各方面功能。
【关键词】：生物人工肝 肝细胞 细胞培养 水凝胶 I型胶原 三维培养 共培养 生物材料 细胞外基质材料
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.3
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-24
• 第一部分 肝细胞三维共培养系统的建立24-35
• 1 材料和仪器24-27
• 2 方法27-30
• 3 结果30-32
• 4 讨论32-35
• 第二部 肝细胞三维共培养体系的优化35-49
• 1 材料35-36
• 2 方法36-41
• 3 结果41-46
• 4 讨论46-49
• 第三部 肝细胞三维共培养系统的功能验证49-59
• 1 材料和仪器49-51
• 2 方法51-53
• 3 结果53-57
• 4 讨论57-59
• 小结59-60
• 参考文献60-70
• 个人简历和研究成果70-71
• 致谢71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 Robert AFM Chamuleau;;Future of bioartifi cial liver support[J];World Journal of Gastrointestinal Surgery;2009年01期

2 赵云山;徐迎新;张博峰;吴欣;刘巨超;张兰;唐利安;黄志强;;以胶原凝胶为支架构建可植入工程化肝组织的实验研究[J];中华医学杂志;2007年29期

3 ;The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients[J];World Journal of Gastroenterology;2003年04期

  本文关键词：以胶原水凝胶为支架体外构建肝细胞三维共培养系统，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：313011