HCoV-OC43感染性克隆的改建与病毒拯救

发布时间：2021-05-25 07:17

　　冠状病毒是目前已知的最大的RNA病毒,其基因组全长为27～31Kb。冠状病毒庞大的基因组以及携带其复制酶序列的质粒在细菌中的不稳定性长期阻碍了冠状病毒反向遗传学的发展,直到2000年Almazan等首次利用DI-RNA和BAC质粒系统成功构建了TGEV的全长cDNA感染性克隆。经过几年的发展,已经成功开发出了三种冠状病毒的拯救系统,包括基于BAC的拯救系统、体外连接覆盖基因组全长的cDNA策略以及基于痘苗病毒载体的拯救系统。HCoV-OC43属于Ⅱ组冠状病毒,其基因组全长约为30.7Kb,为不分节段的单股正链RNA,具有典型的5’帽子结构和3’poly A尾结构。基因组结构为5’-polymerase-HE-S-E-M-N,另外还有两个非结构基因NS2和NS12.9分别位于HE之前以及S和E基因之间,其功能目前还不清楚。由于HCoV-OC43和SARS病毒一样同属于Ⅱ组冠状病毒,因此可以将其作为SARS的模式病毒来研究,以克服SARS研究对P3实验室的依赖性。2006年,加拿大学者成功构建基于BAC系统的HCoV-OC43全长cDNA感染性克隆为我们进一步研究HCoV-OC43提供了很... 

【文章来源】：中国疾病预防控制中心北京市

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词
前言
材料和方法
结果
    第一部分 OC43-FL病毒的拯救及鉴定
        1. pBAC-OC43~(FL)质粒的鉴定
        2. OC43-FL病毒的拯救
        3. OC43-FL病毒的鉴定
        本章小结
    第二部分 带GFP重组pBAC-OC43质粒的构建及鉴定
        1. 构建策略
        2. GFP取代NS2的重组pBAC-OC43的构建与鉴定
            2.1 带GFP的重组片段的构建与克隆
            2.2 GFP取代NS2的重组pBAC-OC43质粒的构建与鉴定
        3. GFP取代NS12.9的重组pBAC-OC43质粒的构建及鉴定
            3.1 带GFP的重组片段的构建与克隆
            3.2 GFP取代NS12.9的重组pBAC-OC43质粒的构建及鉴定
        4. GFP插入N基因后的重组pBAC-OC43质粒的构建及鉴定
            4.1 带GFP的重组片段的构建与克隆
            4.2 GFP插入N基因后的重组pBAC-OC43质粒的构建及鉴定
        本章小结
    第三部分 带GFP的重组HCoV-OC43病毒的拯救及体外鉴定
        1. GFP取代NS2的重组HCoV-OC43病毒的拯救及鉴定
            1.1 GFP表达情况的连续观察
            1.2 免疫荧光和Western blot检测
            1.3 转染细胞的传代扩增
            1.4 上清感染实验
            1.5 细胞冻融裂解上清感染实验
        2. GFP取代NS12. 9的重组HCoV-OC43病毒的拯救及鉴定
            2.1 GFP表达情况的连续观察
            2.2 免疫荧光检测
            2.3 上清感染实验
        3. GFP插入N基因后的重组HCoV-OC43病毒的拯救
        本章小结
讨论
全文总结
参考文献
综述
    RNA病毒感染性克隆技术及其应用
        参考文献
    冠状病毒载体研究进展
        参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3204926