泛素化对多器官功能障碍综合征脾脏树突状细胞功能的调节作用与机制研究

发布时间：2021-06-05 12:17

　　目的：研究多器官功能障碍综合征（multiple organs dysfunction syndrome，MODS）病程中脾脏树突状细胞（dendritic cells，DC）的变化及MHC-Ⅱ蛋白的泛素依赖性作用，证实泛素-蛋白酶体途径在MODS病程中对脾脏DC MHC-Ⅱ变化及DC功能的影响，探讨E3泛素连接酶MARCH1在MODS第一次打击期对脾脏DC MHC-Ⅱ泛素化调节的作用机制，并观察干预MARCH1对MODS第一次打击期脾脏DC免疫功能的影响，进而为MODS的免疫调节与防治寻找新的靶点。方法：采用腹腔注射酵母多糖复制MODS小鼠模型。120只小鼠随机分为正常对照组和MODS1d、3d、5d、7d和10d组。各组实验小鼠分别分离脾脏和胸腺组织，一部分脾脏应用免疫荧光方法检测CD11c+DC数量的变化，剩余组织应用MiniMACS免疫磁珠分别分离DC和T细胞用于体外细胞学实验。运用流式细胞术、Real-Time PCR、Western Blot和MTT法等检测DC对CD86、MHC-Ⅱ、泛素、E3泛素连接酶（MARCH1-8）的表达，DC分泌IL-12、TNF-α的水平以及诱... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：115 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
材料与方法
    一、实验材料
        1、实验试剂与药品
        2、实验仪器
    二、实验动物模型与分组
        1、实验动物模型
        2、实验分组
    三、标本采集与处理
    四、实验方法
        1、脾脏组织 HE 染色光镜观察
        2、脾脏组织免疫荧光染色标记 CD11c+DC 数量
        3、小鼠脾脏 DC 的分离与提取
        4、小鼠胸腺 T 淋巴细胞的分离与提取
        5、流式细胞术检测分离细胞纯度及 DC 凋亡率和表面 CD86、MHC-Ⅱ
        6、Real-Time PCR 检测各种因子 mRNA 水平的表达
        7、Western Blot 检测 MHC-Ⅱ和 MARCH1 蛋白的表达
        8、免疫共沉淀检测 MHC-Ⅱ蛋白的泛素化水平
        9、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体的构建
        10、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体和 SiRNA 的脂质体转染进 DC
        11、Annexin-V/PI 双标记染色法检测 DC 凋亡率
        12、MTT 法检测 T 细胞增殖活性
    五、统计学分析
结果
    第一部分：小鼠 MODS 病程中脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白的泛素相关性研究
        一、MODS 病程中小鼠生理体征的变化
        二、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 的变化
            1、MODS 病程中小鼠脾脏组织病理学的变化
            2、MODS 病程中小鼠脾脏 CD11c+DC 数量的变化
            3、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 表面分子和分泌因子的变化
            4、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 对 T 细胞功能影响的变化
        三、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 泛素和 E3 泛素连接酶表达的变化
            1、MODS 病程中小鼠脾脏 DC 泛素 mRNA 表达的变化
            2、MODS 病程中小鼠脾脏 DC E3 泛素连接酶（MARCH1-8）mRNA 表达的变化
            3、MODS 病程中小鼠脾脏 DC MARCH1 蛋白表达的变化
            4、MODS 病程中 MARCH1 与 MHC-Ⅱ蛋白表达的比较
    第二部分：脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化的分子机制及干预研究
        一、MODS 1d 组 DC MHC-Ⅱ蛋白水平变化的泛素依赖性
            1、MODS 1d 组 DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化水平的变化
            2、正常对照组及 MODS 1d 组 DC 经 MG132 处理前后 MHC-Ⅱ的变化
            3、正常对照组及 MODS 1d 组 DC 经 MG132 处理前后对 T 细胞影响的变化
        二、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体和 MARCH1 siRNA 的构建
            1、pMB-HA-MARCH1 真核表达载体的构建
            2、MARCH1 siRNA 的构建
        三、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 MHC-Ⅱ及 DC 免疫功能影响的变化
            1、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 DC 基本生理状况影响的变化
            2、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 DC MHC-Ⅱ影响的变化
            3、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组 DC 对 T 细胞功能影响的变化
讨论
    一、小鼠 MODS 模型中脾脏 DC 的变化与意义
        1、关于小鼠 MODS 模型的应用与评价
        2、MODS 病程中脾脏 DC 分化、成熟及免疫功能的变化与意义
    二、MODS 中脾脏 DC MHC-Ⅱ的变化规律
    三、在 MODS 病程中泛素-蛋白酶体途径对脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白水平变化的影响作用
        1、MODS 病程中脾脏 DC 泛素 mRNA 水平表达的变化规律
        2、MODS 病程中脾脏 DC E3 泛素连接酶 mRNA 和蛋白水平表达的变化规律
        3、MODS 病程中 MARCH1 与 MHC-Ⅱ蛋白表达的比较
    四、MODS 第一次打击期脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白水平变化的分子机制探讨及干预效应
        1、MODS 1d 组脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白泛素化水平的变化
        2、MODS 1d 组脾脏 DC MHC-Ⅱ泛素化降解途径的分子效应
        3、关于 pMB-HA-MARCH1 真核表达载体和 MARCH1 siRNA 的构建与应用
        4、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组脾脏 DC MHC-Ⅱ蛋白水平及泛素化程度的影响
        5、干预 MARCH1 对 MODS 1d 组脾脏 DC 免疫功能的影响
结论
参考文献
综述
个人简历
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]MODS小鼠脾脏树突细胞PD-1、PD-L1的表达变化及其意义[J]. 刘茜,陆江阳,王晓虹,曲冰杰,李韶然,康佳蕊.  解放军医学杂志. 2010(01)
[2]多器官功能障碍综合征52例尸检脾及脾树突状细胞的病理学观察[J]. 陆江阳,王晓虹,刘茜,杨毅,李玲.  诊断病理学杂志. 2007(03)
[3]辅助性T细胞的研究概况及进展[J]. 王辉,游晶.  世界华人消化杂志. 2007(13)
[4]脾脏树突状细胞在多器官功能障碍综合征中的变化及意义[J]. 陆江阳,李志宏,王晓虹,杨毅,李玲.  中国危重病急救医学. 2006(01)
[5]单核细胞HLA-DR抗原在MODS中的表达及白藜芦醇苷的保护机制[J]. 谭波,王兴勇.  儿科药学杂志. 2005(04)
[6]烧伤脓毒症早期心肌内泛素mRNA的表达变化及意义[J]. 申传安,柴家科,盛志勇,蒋金珩.  解放军医学杂志. 2003(11)
[7]烧伤脓毒症早期膈肌内泛素基因和蛋白的表达变化及意义[J]. 申传安,柴家科,姚咏明,蒋金珩.  中国危重病急救医学. 2003(11)
[8]小鼠迟发型多器官功能障碍综合征模型复制及病理学观察[J]. 孙宇,陆江阳,王晓虹,胡森,杨毅,佟欣.  中国危重病急救医学. 2003(01)
[9]MODS大鼠胸腺树突状细胞病理改变及作用的研究[J]. 陆江阳,王晓虹,孙宇,胡森,杨毅,李玲.  中国危重病急救医学. 2001(11)



本文编号：3212151