组蛋白在脓毒症过程中对淋巴细胞的凋亡作用及机制

发布时间：2017-04-23 06:06

  本文关键词：组蛋白在脓毒症过程中对淋巴细胞的凋亡作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 脓毒症是指由细菌、真菌或病毒感染所诱发的全身炎症反应,是导致休克及器官功能衰竭的常见原因。脓毒症进展迅速,病死率高,已成为重症医学病区的主要死亡原因。脓毒症因其发生、发展机制复杂,增加了疾病在临床上治疗的困难性。 大量研究显示：脓毒症过程中存在大量的免疫细胞及非免疫细胞凋亡,成为免疫抑制及器官损伤的重要因素。其中,不同细胞对凋亡刺激的易感性存在着明显差异,免疫细胞和肠道上皮细胞由于代谢活跃最易发生凋亡。细胞凋亡对免疫系统的后续影响是脓毒症死亡的关键,尤其是免疫细胞,凋亡使免疫细胞的数量明显减少,细胞凋亡后分泌的免疫抑制因子作用于附近的免疫细胞,使具有负性免疫功能的T细胞占据优势,从而固有免疫和获得性免疫能力均受到影响。脓毒症患者外周血中发现的凋亡细胞明显多于非脓毒症对照患者,免疫细胞凋亡介导免疫抑制促使脓毒症病情不断恶化,是脓毒症死亡的关键。在动物实验中,通过阻止或抑制免疫细胞凋亡的治疗已经显示出了一定疗效。 组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白,包括H1、H2A、H2B、H3、H4五种类型,构成核小体的核心,除参与构成染色体结构外还具有异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控等多种主要生理功能。在健康人群或病人体内,均可有细胞外组蛋白出现,它们是由濒死的细胞释放。组蛋白由胞内释放到胞外的机制尚不十分明确,若凋亡或坏死的细胞在死亡过程中释放的核小体超过了机体正常清除能力或者机体清除核小体的能力受损,可导致循环中的组蛋白浓度升高。此外,由中性粒细胞分泌的中性粒细胞胞外诱捕网(1eutrophil extracellular traps, NETs)是由DNA、组蛋白和细胞颗粒蛋白构成的复合物,具有病原微生物清除作用,其中发挥作用的关键物质是组蛋白。在脓毒症过程中NETs大量释放,在抗菌的同时也介导了免疫细胞和组织细胞的广泛损伤。 已有研究证明细胞外组蛋白的释放是脓毒症死亡的主要致死因素,而免疫细胞凋亡介导的免疫抑制是脓毒症死亡的关键。组蛋白和免疫细胞凋亡之间是否存在因果关系尚不清楚。但大量的研究显示组蛋白可以影响钙离子内流、细胞器损伤等细胞凋亡的关键环节,据此,我们提出假设：脓毒症时,组蛋白作用于免疫细胞,通过线粒体损伤、细胞色素C释放及系列caspase活化,介导免疫细胞凋亡。该研究进一步阐述了组蛋白介导免疫细胞凋亡的机制,丰富了脓毒症的发病机理,为未来脓毒症的治疗提供新的理论依据。 研究目的 1.明确脓毒症中是否存在组蛋白释放入血； 2.探讨组蛋白是否促进淋巴细胞凋亡及作用强度； 3.探讨组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的机制； 4.探讨组蛋白抗体能否减轻脓毒症引起的淋巴细胞凋亡。 研究方法 1.检测脓毒症小鼠模型外周血中组蛋白H4的表达 a)动物分组 选取雄性C57小鼠18只(8-12周龄),随机分配至三大组：正常对照组,假手术组(sham组),脓毒症模型组(CLP组)。其中,正常对照组不做任何处理；sham组只打开腹腔,找到盲肠后再置入腹腔,关闭腹腔；脓毒症组采用盲肠结扎穿孔术(Cecal Ligation and Puncture, CLP)。于25℃室温下观察6小时,眼球取血约1mL,至肝素抗凝管,摇匀,分离血浆和淋巴细胞,采用western blot和流式细胞技术分别检测血浆中组蛋白H4和淋巴细胞凋亡率实验重复三次。 b)脓毒症模型建立 小鼠麻醉后固定,备皮,延腹中线切开皮肤,腹白线切开腹膜,腹腔内找到盲肠,于距盲肠末端1/3处结扎,使用21G针头穿孔,盲肠置回腹腔,关闭腹腔,缝合。将术后小鼠放入室温25℃的环境下观察、麻醉苏醒。 c)外周血组蛋白H4检测 0.7mL全血离心后留取血浆,稀释5倍,加Loading Buffer变性、离心,放于-20℃保存。BCA蛋白定量检测各组总蛋白浓度,确定各组总蛋白的上样量,检测各组组蛋白H4的表达量。 d)动物淋巴细胞凋亡率检测 应用密度梯度分离法分离淋巴细胞,nnexinV-FITC/PI避光染色10min,流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。 2.组蛋白促进淋巴细胞凋亡及其作用强度 a)细胞分组 淋巴细胞来源于健康志愿者全血,经淋巴细胞细胞分离步骤,培养于1640培养液中。(1)组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的浓度依赖性：淋巴细胞分为4大组,每组3管,每管2.5×105个细胞,分别与组蛋白Oug/mL (对照组)、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL于37℃培养箱中培养2h,等量1640培养基做对照。(2)组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的时间依赖性：淋巴细胞分为3大组,每组3管,每管2.5×105个细胞,组蛋白100ug/mL,在37℃培养箱中培养0h(对照组)、2h、3h,等体积1640培养基做对照。 b)人血淋巴细胞的提取 抽取健康志愿者静脉血20mL,肝素抗凝,均分为5管,血液：PBS=1：1稀释血液,混匀后分别加入装有4m1淋巴细胞分离液的离心管上层,于25℃离心机1200g离心30min,吸取中间白膜层(富淋巴细胞),经PBS洗涤离心后,用1640培养基重悬所有淋巴细胞至同一EP管中,计数备用。c)人血淋巴细胞凋亡的检测 将处理好的淋巴细胞250g离心5min,弃上清,加入1mL PBS,重悬,离心,弃上清,AnnexinV-FITC/PI避光染色10min, PBS重悬细胞,流式细胞仪分别检测每管的淋巴细胞凋亡率。 d)动物分组 选取雄性C57小鼠20只(8-12周龄),14只用于生存时间研究,随机分配至两大组：正常对照组和组蛋白组,组蛋白组小鼠经尾静脉注射组蛋白75mg/kg,对照组尾静脉注射同等体积的PBS,观察2小时内小鼠的生存情况。6只小鼠用于淋巴细胞凋亡检测,随机分配至两组：组蛋白组和对照组,组蛋白组小鼠经尾静脉注射组蛋白60mg/kg,对照组尾静脉注射同等体积的PBS,观察6h,眼球取血0.1mL,用于淋巴细胞检测。 e)动物淋巴细胞的检测 应用密度梯度分离法分离淋巴细胞,AnnexinV-FITC/PI避光染色10min,流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。 3.组蛋白通过作用于线粒体途径和MAPKp38诱导淋巴细胞凋亡 a)细胞分组 淋巴细胞来源于健康志愿者全血,经淋巴细胞分离后,培养于1640培养液中。(1)线粒体膜损伤检测：淋巴细胞分为5大组,每组3管,每管细胞2.5×105个,分别与组蛋白0ug/mL(对照组)、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL于37℃培养箱中培养2h,等量1640培养基做对照。(2)凋亡相关蛋白检测：淋巴细胞分为3大组,每组3管,每管细胞10×105个/mL,分别与组蛋白Oug/mL(对照组)、50ug/mL、100ug/mL在37℃培养箱中培养2h,等体积1640培养基做对照。 b)人血淋巴细胞的提取 具体方法同前。 c)线粒体膜损伤检测 将处理好的细胞离心弃去上清,加入Rhodamine123染色剂0.5ug/ml,于37℃孵育0.5h,流式细胞仪检测线粒体膜损伤程度。d)线粒体膜蛋白Bcl-2检测 将处理好的细胞250g离心10min, PBS lml分别洗涤,再离心弃去上清,加入细胞裂解液,提取蛋白,变性后存储于-20℃。以GAPDH为参照蛋白行免疫印迹(western blot)检测,确定各组总蛋白量基本一致的上样量,行westernblot检测各组蛋白浓度组Bcl-2的表达。e)细胞信号通路p38活化 将处理好的细胞250g离心1(min, PBS lml分别洗涤,再离心弃去上清,加入细胞裂解液,提取蛋白,变性后存储于-20℃。以GAPDH为参照蛋白行免疫印迹(western blot)检测,确定各组总蛋白量基本一致的上样量,行westernblot检测各组蛋白浓度组磷酸化的p38的量。f) Caspase3活化检测 将处理好的细胞250g离心10mmin,PBS1ml分别洗涤,再离心弃去上清,加入细胞裂解液,提取蛋白,变性后存储于-20℃。以GAPDH为参照蛋白行免疫印迹(western blot)检测,确定各组总蛋白量基本一致的上样量,行westernblot检测各组蛋白浓度组Caspase3的活化。4.组蛋白H4中和抗体减轻脓毒症引起的淋巴细胞凋亡a)细胞分组 淋巴细胞来源于健康志愿者全血,经淋巴细胞细胞分离步骤,培养于1640培养液中。淋巴细胞分为6大组,每组3管,分别为正常对照组,sham对照组,脓毒症组,IgG抗体组,组蛋白H4抗体10ug组,组蛋白H4抗体25ug组。脓毒症组及IgG抗体、组蛋白H4抗体组细胞加入40uL脓毒症CLP模型小鼠的血浆,sham对照组加入40uL假手术小鼠血浆。各抗体组分别加入同体积IgG抗体25ug/mL、组蛋白H4抗体10ug/mL、组蛋白H4抗体25ug/mL,37℃培养箱中培养2h,等体积1640培养基做对照。 b)人血淋巴细胞提取 具体方法同前。 c)人血淋巴细胞凋亡检测 将处理好的细胞250g离心10min, PBS1ml分别洗涤,再离心弃去上清,AnnexinV-FITC/PI避光染色10min, PBS重悬细胞,使用流式细胞仪分别检测每管的淋巴细胞凋亡率。 5.统计学方法 图表绘制及数据分析均采用SPSS19.0统计学软件,数据结果使用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用Dunnett's t检验和Bonferroni's t检验,P值小于0.05被认为有意义。生存分析采用Kaplan-Meier方法,P值小于0.05被认为有意义。 研究结果 1.脓毒症模型小鼠的外周血组蛋白H4水平及淋巴细胞凋亡率 Western blot结果显示CLP组小鼠外周血大量表达H4蛋白,而sham组及正常对照组未见表达,并且CLP组小鼠外周血的淋巴细胞凋亡率显著升高,CLP组细胞凋亡率较正常对照组增加13.23+1.50%,明显高于sham组,较对照组增加3.23±1.39%,不同组间存在显著性差异(F=101.895,p=0.000)。 2.组蛋白引起淋巴细胞凋亡的强度：浓度依赖性及时间依赖性 不同组蛋白浓度组间淋巴细胞凋亡率有显著差异(F=35.921,p=0.000)。组蛋白Oug/mL(对照组)、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL组的淋巴细胞凋亡率分别为15.64±2.44%,77.98±2.90%,93.61±2.86%,94.30±3.31%。 100ug/mL组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的2小时组和3小时组与对照组相比有显著性差异(F=377.823,p=0.000),而2小时组与3小时组组间淋巴细胞凋亡率没有显著性差异(*p=0.918)。对照组、2小时组和3小时组的淋巴细胞凋亡率分别为14.93±2.87%,93.76±3.43%,97.55±2.73%。2小时组淋巴细胞主要为早期凋亡,早期凋亡率为89.54±2.02%；3小时淋巴细胞主要为晚期凋亡,晚期凋亡率为91.80±1.54%。 小鼠体内,组蛋白组淋巴细胞的凋亡率较对照组显著增加(F=70.41,p=0.001),PBS组淋巴细胞凋亡率为36.6±1.31%,组蛋白组的淋巴细胞凋亡率为48.62+0.72%。小鼠存活实验中组蛋白组小鼠较正常对照组的2小时的累计生存率明显减少(χ2=27.56,p=0.000)。 3.组蛋白诱导淋巴细胞凋亡通过线粒体途径和MAPKp38 组蛋白组正常跨膜电位的线粒体较正常对照组显著减少(F=31.937,*p=0.000)。组蛋白Oug/mL(对照组)、25ug/ml、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL组的淋巴细胞线粒体损伤百分比为：65.27±3.83%,42.15±11.13%,34.19±12.38%,18.4±2.02%,6.30±1.15%。 Western blot结果显示组蛋白50ug/mL、100μmL组活化的Caspase3表达量较对照组显著增多(F=105.470, p=0.000)。500ug/mL、100ug/mL的比值比分别为：同时组蛋白50ug/mL、10ug/mL组磷酸化的p38表达量较对照组显著性增多(F=239.503,p=0.000)。而组蛋白50ug/mL、100ug/mL组的Bcl-2的表达量较对照组显著性减少(F=73.465,p=0.000)。 4.组蛋白H4抗体对脓毒症引起的淋巴细胞凋亡的作用 组蛋白组淋巴细胞凋亡率与IgG组及CLP组有显著差异(F=21.140,*p=0.000)。sham组、脓毒症组、IgG组、组蛋白H4抗体10ug/mL、25ug/mL组的淋巴细胞凋亡率分别为44.20±9.61%,73.18±2.44%、68.45±1.56%、55.68+2.60%和35.29±1.34%。 实验结论 1.脓毒症时细胞外组蛋白在淋巴细胞凋亡中发挥了重要作用。 2. MAPK p38磷酸化、线粒体损伤及Caspase3活化是组蛋白介导淋巴细胞凋亡的重要途径。
【关键词】：组蛋白 脓毒症 凋亡 淋巴细胞 线粒体 p38
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-23
• 第一章 脓毒症模型中组蛋白释放及淋巴细胞凋亡23-36
• 1.1 研究目的23
• 1.2 材料与方法23-32
• 1.3 结果32-33
• 1.4 讨论33-36
• 第二章 组蛋白对淋巴细胞的凋亡作用36-49
• 2.1 研究目的36
• 2.2 材料和方法36-42
• 2.3 结果42-45
• 2.4 讨论45-49
• 第三章 组蛋白作用于淋巴细胞凋亡的机制49-60
• 3.1 实验目的49
• 3.2 材料和方法49-52
• 3.3 结果52-56
• 3.4 讨论56-60
• 第四章 组蛋白H4抗体对淋巴细胞的保护作用60-65
• 4.1 研究目的60
• 4.2 材料和方法60-62
• 4.3 结果62
• 4.4 讨论62-65
• 全文小结65-70
• 参考文献70-76
• 中英文对照与缩略词表76-77
• 学习期间发表论文77-78
• 致谢78-79

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