HDAC抑制剂调控激活血小板诱导的NETs形成的实验性研究
发布时间：2021-08-02 08:30
目的:NETs过度形成在脓毒症、缺血再灌注损伤和脑卒中等急危重症病理生理过程中的作用已经被证实,但由于体内NETs形成失调的机制十分复杂,目前尚无有效手段对其进行干预。近年来,大量研究发现血小板激活失调是体内NETs过度形成的重要诱导因素。本课题组前期研究发现HDAC抑制剂可以削弱脓毒症休克小鼠血清NETs标记物的升高,另有研究发现HDAC参与血小板激活。因此,本课题尝试建立激活血小板诱导NETs形成的技术体系,为进一步揭示血小板激活和NETs形成的内在联系提供技术支持,同时评估HDAC抑制剂对激活血小板分泌和NETs诱导能力的影响,探索HDAC抑制剂器官功能保护作用的机制。研究方法:采集健康人静脉血,分离新鲜血小板和中性粒细胞。分离所得血小板在体外用血小板激活剂预处理,而后将预处理血小板和中性粒细胞共培养以诱导NETs形成。在培养基中加入细胞外核酸染料Sytox green,于培养期间持续重复测量悬液中Sytox green的荧光强度。用测得数据建立荧光强度-时间动力曲线以对NETs形成进行动态监测和定量分析。利用活细胞显像和免疫荧光技术对NETs形成进行定性分析。通过比较荧光强度随...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
激活血小板诱导NETs形成技术体系的示意图
中国医科大学硕士学位论文62.3.2标本采集静脉血标本来自于面向社会招募的健康成年志愿者。志愿者的纳入标准如下：年龄18至50周岁；无再生障碍性贫血或粒细胞缺乏症等血液系统疾病史；无系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病史；无艾滋病或梅毒等传染性疾病史；无糖尿病或库欣病等内分泌疾病史；无高血压或冠心病等心血管病史；无肿瘤病史；无免疫抑制治疗病史；自愿签署知情同意书。志愿者的排除标准如下：年龄小于18周岁或大于50周岁；有上述疾病史；近2周内患感染性疾病；近1月内服用过抗血小板或抗凝药物；不签署知情同意书。招募入组的志愿者根据个人意愿接受1至5次静脉采血，每次采血6至18ml，具体量由当日所需进行的实验而定，静脉穿刺采血由中国医科大学附属第一医院急诊科的专业医护人员完成，操作过程均达到标准化。具体如下：医护人员先对志愿者进行肘正中静脉穿刺，穿刺后用EDTA抗凝管或柠檬酸抗凝管收集静脉血，采集的静脉血立即用于中性粒细胞或血小板的分离。2.3.3中性粒细胞的分离和体外培养图2中性粒细胞分离和体外培养的流程图利用密度梯度离心法分离中性粒细胞，根据不同实验进行相应条件的体外培养（图2）。具体如下：用水浴锅将4℃保存的Hisopauqe-1119预热到28℃，而后加入6mlHistopaque-1119到无菌15ml离心管中。取Percoll原液，按9:1（Percoll
中国医科大学硕士学位论文82.3.4血小板的分离和体外培养图3血小板分离和体外培养的流程图利用离心法分离血小板，根据不同实验进行相应条件的体外培养（图3）。具体如下：用柠檬酸抗凝管收集静脉血，而后按10:1.5（全血:ACD-A抗凝剂，体积:体积）向抗凝血中加入无菌的ACD-A抗凝剂并轻柔混匀。用300×g离心10min，离心时使用缓慢升速和无阻力减速模式。离心后收集上层富血小板血浆到一无菌10ml离心管中。用450×g离心5min，离心时使用缓慢升速和无阻力减速模式。离心后弃上清，用预先加入10mMHEPES的RPMI1640培养基重悬底部血小板团块。用血常规仪检测所得血小板悬液浓度和纯度，而后将血小板悬液浓度调整到100×106cell/ml。将同一志愿者的血小板悬液分为数份，而后分别加入对应刺激物，具体如下：PLT+TRAP组加入50μM（最终浓度）TRAP-6，PLT+TRAP+SAHA组加入50μM（最终浓度）TRAP-6和10mM（最终浓度）SAHA，PLT组不加刺激物。加完刺激物后用培养基将各组体积补齐以保持血小板浓度一致，而后将标本放入细胞培养箱中，用37℃、5%CO2培养30min。2.4标本检测2.4.1动态监测DNA释放按前述方法准备标本，完成后向细胞悬液中加入1.25μM（最终浓度）Sytoxgreen，再按10^5cell/孔（中性粒细胞数）将混合细胞悬液种入黑壁底透的96孔板中。种植后将标本转移到酶标仪中，设置37℃恒温培养2h（PMA诱导NETs的实验时为3h）。在培养期间，用485nm的激发光重复测量各孔内的荧光强度，
【参考文献】：
期刊论文
[1]双链DNA与急性ST段抬高型心肌梗死的相关性分析[J]. 王西强,杨丹丹,刘静,范修德,马爱群,刘平. 中国医科大学学报. 2019(11)
[2]外周血游离DNA/NETs在脓毒症诊断和预后评估中的应用价值[J]. 孟强,屈峰,董伟,张昊. 中国呼吸与危重监护杂志. 2018(03)
[3]血清cf-DNA对腹部外伤合并脓毒症患者预后的预测价值[J]. 王永乐,王凯,王士凯,孙世龙,谢天,丁威威. 江苏医药. 2018(02)
[4]中性粒细胞胞外诱捕网与急性ST段抬高型心肌梗死的相关性[J]. 王西强,杨丹丹,白鸿远,刘平. 实用医学杂志. 2016(23)
[5]外周血cf-DNA/NETs水平在脓毒症患者中的临床价值研究[J]. 张春容,陶武. 重庆医学. 2015(20)
硕士论文
[1]中性粒细胞胞外诱捕网在急性脑梗死动脉血栓形成中作用的研究[D]. 王欢.第三军医大学 2015
本文编号：3317241
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
激活血小板诱导NETs形成技术体系的示意图
中国医科大学硕士学位论文62.3.2标本采集静脉血标本来自于面向社会招募的健康成年志愿者。志愿者的纳入标准如下：年龄18至50周岁；无再生障碍性贫血或粒细胞缺乏症等血液系统疾病史；无系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病史；无艾滋病或梅毒等传染性疾病史；无糖尿病或库欣病等内分泌疾病史；无高血压或冠心病等心血管病史；无肿瘤病史；无免疫抑制治疗病史；自愿签署知情同意书。志愿者的排除标准如下：年龄小于18周岁或大于50周岁；有上述疾病史；近2周内患感染性疾病；近1月内服用过抗血小板或抗凝药物；不签署知情同意书。招募入组的志愿者根据个人意愿接受1至5次静脉采血，每次采血6至18ml，具体量由当日所需进行的实验而定，静脉穿刺采血由中国医科大学附属第一医院急诊科的专业医护人员完成，操作过程均达到标准化。具体如下：医护人员先对志愿者进行肘正中静脉穿刺，穿刺后用EDTA抗凝管或柠檬酸抗凝管收集静脉血，采集的静脉血立即用于中性粒细胞或血小板的分离。2.3.3中性粒细胞的分离和体外培养图2中性粒细胞分离和体外培养的流程图利用密度梯度离心法分离中性粒细胞，根据不同实验进行相应条件的体外培养（图2）。具体如下：用水浴锅将4℃保存的Hisopauqe-1119预热到28℃，而后加入6mlHistopaque-1119到无菌15ml离心管中。取Percoll原液，按9:1（Percoll
中国医科大学硕士学位论文82.3.4血小板的分离和体外培养图3血小板分离和体外培养的流程图利用离心法分离血小板，根据不同实验进行相应条件的体外培养（图3）。具体如下：用柠檬酸抗凝管收集静脉血，而后按10:1.5（全血:ACD-A抗凝剂，体积:体积）向抗凝血中加入无菌的ACD-A抗凝剂并轻柔混匀。用300×g离心10min，离心时使用缓慢升速和无阻力减速模式。离心后收集上层富血小板血浆到一无菌10ml离心管中。用450×g离心5min，离心时使用缓慢升速和无阻力减速模式。离心后弃上清，用预先加入10mMHEPES的RPMI1640培养基重悬底部血小板团块。用血常规仪检测所得血小板悬液浓度和纯度，而后将血小板悬液浓度调整到100×106cell/ml。将同一志愿者的血小板悬液分为数份，而后分别加入对应刺激物，具体如下：PLT+TRAP组加入50μM（最终浓度）TRAP-6，PLT+TRAP+SAHA组加入50μM（最终浓度）TRAP-6和10mM（最终浓度）SAHA，PLT组不加刺激物。加完刺激物后用培养基将各组体积补齐以保持血小板浓度一致，而后将标本放入细胞培养箱中，用37℃、5%CO2培养30min。2.4标本检测2.4.1动态监测DNA释放按前述方法准备标本，完成后向细胞悬液中加入1.25μM（最终浓度）Sytoxgreen，再按10^5cell/孔（中性粒细胞数）将混合细胞悬液种入黑壁底透的96孔板中。种植后将标本转移到酶标仪中，设置37℃恒温培养2h（PMA诱导NETs的实验时为3h）。在培养期间，用485nm的激发光重复测量各孔内的荧光强度，
【参考文献】：
期刊论文
[1]双链DNA与急性ST段抬高型心肌梗死的相关性分析[J]. 王西强,杨丹丹,刘静,范修德,马爱群,刘平. 中国医科大学学报. 2019(11)
[2]外周血游离DNA/NETs在脓毒症诊断和预后评估中的应用价值[J]. 孟强,屈峰,董伟,张昊. 中国呼吸与危重监护杂志. 2018(03)
[3]血清cf-DNA对腹部外伤合并脓毒症患者预后的预测价值[J]. 王永乐,王凯,王士凯,孙世龙,谢天,丁威威. 江苏医药. 2018(02)
[4]中性粒细胞胞外诱捕网与急性ST段抬高型心肌梗死的相关性[J]. 王西强,杨丹丹,白鸿远,刘平. 实用医学杂志. 2016(23)
[5]外周血cf-DNA/NETs水平在脓毒症患者中的临床价值研究[J]. 张春容,陶武. 重庆医学. 2015(20)
硕士论文
[1]中性粒细胞胞外诱捕网在急性脑梗死动脉血栓形成中作用的研究[D]. 王欢.第三军医大学 2015
本文编号：3317241
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