脐带间充质干细胞外泌体在急性肝衰竭中对巨噬细胞NLRP3炎症小体的调节作用

发布时间：2022-04-28 21:41

　　第一部分:观察hUCMSCs外泌体对巨噬细胞RAW264.7中NLRP3炎症小体活化的影响目的:观察人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）来源的外泌体可否抑制LPS诱导的小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞中NLRP3炎症小体的过度活化以及其下游炎症因子的过度表达。方法:收集hUCMSCs培养上清液并提取外泌体,通过Western blot分析外泌体特征标记蛋白,纳米粒子示踪法检测外泌体浓度和粒径,流式细胞仪测定平均外泌体直径,透射电子显微镜观察典型的外泌体形状;PKH 67标记外泌体,观察巨噬细胞对外泌体的摄取情况;巨噬细胞按2×106/孔接种于6孔板中,随机分为4组:巨噬细胞对照组,巨噬细胞+LPS组,巨噬细胞+LPS+hUCMSCs外泌体组,巨噬细胞+hUCMSCs外泌体组,每组3个复孔。收集细胞培养上清液及细胞总蛋白,通过Western blot检测巨噬细胞中NLRP3,Caspase-1的蛋白表达水平;通过ELISA检测细胞培养上清中的IL-1β和IL-6的分泌水平。结果:巨噬细胞+LPS组中,NLRP3,Caspase-1蛋白表达明显升高,IL-1β和IL-6分泌增多,巨... 

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 观察hUCMSCs来源外泌体对RAW264.7巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的影响
    1.1 研究背景
    1.2 材料与仪器
        1.2.1 材料
        1.2.2 主要仪器设备与器材
    1.3 实验方法
        1.3.1 细胞培养
        1.3.2 hUCMSCs的流式鉴定
        1.3.3 hUCMSCs的成脂成骨诱导分化鉴定
        1.3.4 巨噬细胞的培养与传代
        1.3.5 细胞的冻存与复苏
        1.3.6 hUCMSCs来源外泌体的提取与鉴定
        1.3.7 hUCMSCs来源外泌体对巨噬细胞的作用
        1.3.8 hUCMSCs外泌体处理炎症环境下巨噬细胞
        1.3.9 细胞培养上清及细胞蛋白的收集
        1.3.10 hUCMSCs外泌体调节巨噬细胞炎症小体NLRP3及其下游炎症因子的表达
        1.3.11 ELISA检测细胞培养上清液中分泌的IL-1β、IL-6因子水平
    1.4 实验结果
        1.4.1 hUCMSCs衍生的外泌体对巨噬细胞的影响
        1.4.2 人脐带间充质干细胞来源外泌体的鉴定
        1.4.3 巨噬细胞对外泌体的摄取
        1.4.4 hUCMSCs外泌体可降低巨噬细胞NLRP 3的活化
        1.4.5 细胞上清液ELISA结果显示,IL-6、IL-1β(pg/ml)的含量如下所示
    1.5 统计方法
第二部分: hUCMSCs来源外泌体在急性肝损伤小鼠模型的保护作用
    2.1 研究背景
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 材料
        2.2.2 实验仪器设备
        2.2.3 实验动物
    2.3 实验方法
        2.3.1 急性肝衰竭模型的建立与hUCMSCs外泌体的干预
        2.3.2 动物的麻醉
        2.3.3 组织标本的取材与固定
        2.3.4 组织的脱水与石蜡切片的制备
        2.3.5 肝组织病理切片的苏木素&伊红染色(HE染色)
        2.3.6 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测肝组织中NLRP3炎症小体及相关蛋白的表达
        2.3.7 炎症因子含量测定及肝功能的检测
    2.4 实验结果
        2.4.1 hUCMSCs的外泌体对D-Ga1N/LPS所致急性肝衰竭的保护作用
        2.4.2 hUCMSCs外泌体抑制急性肝损伤小鼠NLRP3的激活
    2.5 统计方法
第三章 讨论
全文总结
参考文献
中英文缩写词对照表
攻读学位期间成果
致谢



本文编号：3649588