MKP-1作为潜在抗炎药物作用靶点用于治疗脓毒症的研究

发布时间：2023-02-12 10:29

　　脓毒症(Sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合,可导致多器官功能障碍甚至死亡。脓毒症是当前重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)面临的棘手难题,是除冠心病外ICU病人死亡的首要原因。一方面因为脓毒症由不同的微生物引起,导致相应的疫苗难以开发;另一方面,由于抗生素的滥用,耐药菌株不断产生,应用抗生素控制感染越发困难。因此,尽管对于脓毒症的发病机制的研究取得了很大的进展,目前对于脓毒症的治疗,仍然没有特效的药物。所以,人们迫切需要发展新型的治疗脓毒症的方法。第一部分DUSP1启动子荧光素酶报告基因RAW264.7细胞体系的建立以及测试丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1(Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1,MKP-1)是一种可诱导的细胞核磷酸酶,能使丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)去磷酸化,因此,它是MAPK活动的负性调控因子。研究发现MKP-1在固有免疫和适应性免疫反应中都是一个关键的内源性负性调控因子,用敲除MKP-1的小鼠研究发现MKP-...

【文章页数】：91 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 DUSP1启动子荧光素酶报告基因RAW264.7细胞体系的建立以及测试
    前言
    1.1 材料和方法
        1.1.1 主要试剂
        1.1.2 主要仪器
        1.1.3 RAW264.7细胞的培养
        1.1.4 pGL4.19/PrDUSP1质粒的转化
        1.1.5 挑阳性克隆,摇菌,提质粒(用去内毒素中提试剂盒)
        1.1.6 G418最佳浓度的筛选
        1.1.7 电转染、细胞筛选和单克隆化
        1.1.8 荧光素酶活性检测
        1.1.9 RNA提取及逆转录
        1.1.10 实时荧光定量PCR (RT-PCR)
        1.1.11 统计分析
    1.2 结果
        1.2.1 pGL4.19质粒载体图谱
        1.2.2 RAW264.7/PrDUSP1稳定表达细胞的筛选
        1.2.3 稳定表达细胞荧光素酶活性呈时间依赖性
        1.2.4 Rolipram可增加荧光素酶活性的表达
        1.2.5 Rolipram能上调RAW264.7细胞MKP-1 mRNA的表达
    1.3 讨论
    参考文献
第二部分 Rolipram对脓毒症小鼠治疗作用的研究
    前言
    2.1 材料和方法
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 实验动物
        2.1.4 RAW264.7细胞的培养
        2.1.5 细胞培养上清的收集
        2.1.6 LPS引起的脓毒症小鼠生存率实验
        2.1.7 小鼠血清、肺、肝和肾样品收集
        2.1.8 细胞因子检测
        2.1.9 石蜡切片和HE染色
        2.1.10 血清生化指标检测
        2.1.11 支气管肺泡灌洗、灌洗液总细胞计数、中性粒细胞计数和总蛋白测定
        2.1.12 细胞总蛋白和组织总蛋白的提取与BCA蛋白定量
        2.1.13 Western-blot
        2.1.14 肺组织免疫荧光
        2.1.15 致病性大肠杆菌引起的脓毒小鼠生存率实验
        2.1.16 CLP模型小鼠生存率实验
        2.1.17 统计分析
    2.2 结果
        2.2.1 Rolipram能抑制LPS引起的RAW264.7细胞培养上清中促炎细胞因子的释放
        2.2.2 Rolipram能大幅提高LPS引起的脓毒症小鼠的生存率
        2.2.3 Rolipram能降低LPS引起的脓毒症小鼠血清中促炎细胞因子的生成
        2.2.4 Rolipram能减轻LPS引起脓毒症小鼠的肺损伤
        2.2.5 Rolipram能减轻LPS引起的肝和肾功能损伤
        2.2.6 Rolipram能抑制小鼠肺中LPS引起的NF-κB信号通路的激活
        2.2.7 Rolipram能抑制小鼠肺中LPS引起的MAPK信号通路的激活
        2.2.8 Rolipram能大幅提高大肠杆菌引起的脓毒症小鼠的生存率和CLP模型小鼠的生存率
    2.3 讨论
    参考文献
英文缩写词表
攻读博士学位期间成果
致谢



本文编号：3740933