亚型CD200阳性的胎盘绒毛膜间充质干细胞促进人肝细胞再生

发布时间：2017-06-26 04:05

  本文关键词：亚型CD200阳性的胎盘绒毛膜间充质干细胞促进人肝细胞再生，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：既往研究认为,人胎盘间充质干细胞对治疗急性肝衰竭是有益的。在急性肝衰竭中,巨噬细胞和其分泌的肿瘤坏死因子-α (TNF-α)是参与肝细胞凋亡和急性肝衰竭发展的主要因素之一。CD200阳性人胎盘间充质干细胞(CD200positive human placenta mesenchymal stem cells, CD200+hPMSCs)通过与表达在NK细胞、巨噬细胞和DC细胞等上的CD200受体结合,可抑制这些细胞活性、转变免疫反应的类型和抑制巨噬细胞释放TNF-α。目前,间充质干细胞对肝脏再生方面的研究较多,如改善肝脏代谢,抑制肝脏纤维化以及抑制肝细胞凋亡等,部分并已应用临床疾病的治疗。然而,CD200'hPMSCs对人肝脏再生的影响仍然研究较少。 目的：探讨在共培养系统中,CD200阳性的人胎盘绒毛膜间充质干细胞(CD200positive human placenta chorionic mesenchymal stem cells, CD200+hPCMSCs)对人正常肝细胞代谢、增殖和凋亡的影响。 方法：利用Ⅱ型胶原酶和胰酶消化法从胎盘绒毛膜中分离胎盘绒毛膜间充质干细胞(hPCMSCs),免疫磁珠分选法从hPCMSCs中富集CD200+hPCMSCs。采用生理盐水和Ⅱ型胶原酶两步灌流法分离人原代肝细胞。在合成代谢与增殖实验中,实验分为阴性对照组(0.5%FBS培养基对照,单独培养干细胞上清液对照),对照组(单独培养肝细胞对照)和共培养组(CD200+hPCMSCs:人肝细胞=1：3、1：1和3：1,分别三组)。测定不同组中人原代肝细胞分泌白蛋白和尿素的量,分析不同数量CD200+hPCMSCs对人肝细胞合成代谢的影响；MTT比色法测定不同组中人HL7702肝细胞的增殖水平,评估不同数量CD200+hPCMSCs对人肝细胞增殖的影响。在凋亡实验中,设阴性对照组,凋亡组和抗凋亡组。采用显微镜观察凋亡形态、Annexin-V/PI标记不同组中凋亡的HL7702肝细胞和流式细胞仪检测HL7702肝细胞的凋亡比率,以评估相同数量CD200+hPCMSCs对人肝细胞凋亡的影响。Western blot检测人HL7702肝细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL、Bax和Caspase-3在不同组中的表达水平,进一步评估相同数量的CD200+hPCMSCs对人肝细胞凋亡影响的干预机理。 结果：在合成代谢实验中,各共培养组与对照组中尿索分泌量(1.93±0.42mg/dl)和蛋白分泌量(85.63±4.02ng/ml)相比,共培养细胞比例为1：3组,尿素和白蛋白分泌量变化均无统计学意义(尿素量为2.53±0.26mg/dl,P=0.418:自蛋白量为69.15±2.38ng/ml,P=0.926);比例为1：1组,尿索和白蛋白分泌量均高于对照组(尿素量2.99±0.74mg/dl,P=0.063;白蛋白量172.52±45.19ng/ml,P 0.05):比例为3：1组,尿素和白蛋白分泌量也均高于对照组(尿素量3.35±0.24mg/dl,P0.05；白蛋白量249.25±49.83ng/ml,P0.01)。在增殖试验中，共培养24小时后，1：1组中HL7702肝细胞增殖水平(114.10±2.75%,P0.01)和3：1组HL7702肝细胞增殖水平(127.16±5.15%,P0.01)均高于对照组(100%±0.00%)；而与对照组相比,在1：3组中HL7702肝细胞增殖没有统计学差异(97.20±1.85%,P=0.391)。在培养48小时,1：3组(133.36±0.70%,P0.05),1：1组(133.86±3.30%,P0.05)和3：1组(142.50±12.30%,,P0.05)HL7702肝细胞的增殖水平均较对照组(130.03±0.55%)高。同时,在培养72小时,1：3组(161.73±1.96%,P0.01),1：1组(164.90±0.75%,P0.01)和3：1组(171.30±5.40%,P0.01)肝细胞的增殖水平也均高于对照组(139.40±1.85%)。此外,在凋亡实验中,诱导HL7702肝细胞凋亡24h,显微镜观察发现：抗凋亡组HL7702肝细胞凋亡数少于凋亡组,且抗凋亡组中肝细胞膜皱缩,细胞核碎裂程度明显少于凋亡组。在诱导凋亡12h时,流式细胞仪分析提示：抗凋亡组HL7702肝细胞凋亡阳性率(14.30±0.1414%)低于凋亡组HL7702肝细胞凋亡阳性率(20.40±1.4142%),P0.01.Western blot结果表明：在培养12h和24h,抗凋亡组抗凋亡Bcl-xL蛋白1相对表达量(Bcl-xL/β-actin)均高于凋亡组；在培养12h和24h时,抗凋亡组促凋亡Caspase-3蛋白相对表达最(Caspase-3/β-actin)均低于凋亡组。 结论：CD200+hPCMSCs增强人正常肝细胞的合成代谢、促进肝细胞的增殖以。通过增强抗凋亡Bcl-xL蛋白和降低促凋亡Caspase-3蛋白的表达来抑制肝细胞凋
【关键词】：CD200 胎盘绒毛膜间充质干细胞 肝细胞 再生 凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.3
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的13
• 研究方法13-15
• 1 对象和方法15-29
• 1.1 研究对象15
• 1.2 分组15
• 1.3 主要仪器设备及器材15-16
• 1.4 主要实验试剂16-17
• 1.5 主要试剂的配置17-19
• 1.6 人hPCMSCs的分离、培养和纯化19-20
• 1.7 hPCMSCs流式细胞仪检测20-21
• 1.8 磁珠分选CD200~+hPCMSCs21
• 1.9 正常人原代肝细胞的分离、培养21-22
• 1.10 正常人HL7702肝细胞的复苏与培养22-23
• 1.11 CD200~+hPCMSCs与人正常原代肝细胞共培养23
• 1.12 双夹心ELISA法和比色法测定白蛋白23-24
• 1.13 化学发光法和比色法测定尿素24
• 1.14 CD200~+hPCMSCs与HL7702肝细胞有共培养24-25
• 1.15 MTT比色法分析HL7702肝细胞增殖25
• 1.16 显微镜观察CD200~+hPCMSCs对HL7702肝细胞凋亡的影响25
• 1.17 Annexin-V/PI试剂盒检测HL7702肝细胞凋亡25-26
• 1.18 Western Blot测定凋亡相关蛋白Bcl-xL,Bax和caspase-326-29
• 1.19 统计学分析29
• 2 结果29-36
• 2.1 hPCMSCs的特征29-31
• 2.2 磁珠分选CD200~+hPCMSCs从hPCMSCs31
• 2.3 CD200~+hPCMSCs增强了人原代肝细胞白蛋白的合31-32
• 2.4 CD200~+hPCMSCs增强了人原代肝细胞尿素的合32
• 2.5 CD200~+hPCMSCs促进了HL-7702肝细胞增殖32-33
• 2.6 显微镜下观察HL-7702肝细胞的凋亡33-34
• 2.7 CD200~+hPCMSCs抑制了HL-7702肝细胞的凋亡34-35
• 2.8 CD200~+hPCMSCs上调了凋亡相关蛋白 Bcl-xL和下调了凋亡相关蛋白caspase-3的表达35-36
• 3 讨论36-41
• 3.1 CD200~+hPCMSCs的由来及课题设计分析36-37
• 3.2 CD200~+hPCMSCs对肝细胞代谢影响分析37-38
• 3.3 CD200~+hPCMSCs对肝细胞有丝分裂影响的分析38
• 3.4 CD200~+hPCMSCs对肝细胞凋亡影响的分析38-41
• 结论41-43
• 参考文献43-46
• 发表论文和参加科研情况说明46-47
• 综述47-61
• 综述参考文献58-61
• 致谢61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈辉 ,肖卫民 ,张阳德;肝细胞生长因子对TNF-α诱导肝细胞凋亡的保护作用及其机制的研究[J];中国现代医学杂志;2002年14期

  本文关键词：亚型CD200阳性的胎盘绒毛膜间充质干细胞促进人肝细胞再生，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：484695