抗菌型间充质干细胞的构建与功能鉴定

发布时间：2017-08-06 18:15

  本文关键词：抗菌型间充质干细胞的构建与功能鉴定

  更多相关文章： 脓毒症 间充质干细胞 基因修饰 抗菌蛋白 融合蛋白 杀菌/通透性增加蛋白 LL37

【摘要】：脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征,病情恶化快,死亡率高,是严重烧、创伤患者、肿瘤等危重病患者晚期死亡的主要原因。目前尚无针对脓毒症的特效治疗方法,当前的治疗方案仍是抗感染和涉及几乎所有系统的全身支持治疗,研究进展也迟迟没有突破。值得欣慰的是,近年来研究发现干细胞不仅具有再生修复功能,还具有免疫调节和抗炎的特性。干细胞移植对于脊髓损伤、心肌缺血性损伤、急性肺损伤、急性脑损伤和骨股头坏死等组织损伤性疾病的治疗显示了出好的疗效。此外,干细胞移植治疗脓毒症方面也显示出惊人在疗效。干细胞一方面可通过旁分泌作用,分泌一些如TGF-β、IL-10、IL-13和TSG-6等抗炎细胞因子,进而调节机体的炎症反应;另一方面,干细胞还可直接与树突状细胞、NK细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞相互作用,直接调控这些免疫细胞的功能,在抗炎和免疫调控中发挥重要作用。动物实验显示干细胞移植治疗脓毒症有明显的疗效,大大降低的死亡率,并有效控制机体的过度炎症反应。杀菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)是一种从中性粒细胞初级颗粒中释放的55kDa大小的抗菌肽,具有革兰阴性细胞毒作用和LPS中和能力,是先天免疫系统的组成部分。r BPI21是由野生型BPI蛋白N?端的21 k Da的片段组成的重组蛋白,其较野生型蛋白具有更强、更稳定的生物学功能。在基于动物实验的研究中rBPI21被证实对肺炎、脓毒症等感染性疾病都有保护效应,更重要的是其在临床试验中也显示了治疗效果。LL-37是Cathelicidin抗菌蛋白家族在人类身上的唯一成员,它可以被多种组织和细胞分泌,具有杀灭和抑制多种病原微生物生长的活性,不易耐药,对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌和病毒都有作用,对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌和病毒都有作用。近年来的研究还发现了LL-37具有免疫调节和促愈的作用。本研究着眼于脓毒症的疾病特点和研究现状,提出“抗菌、抗内毒素、抗炎和组织器官保护综合治疗”的治疗策略,并寻求和验证可应用于该策略的治疗药物。目的:1.将rbpi21和与之类似的阳离子抗菌肽ll-37融合,以期获得抗菌能力增强且具备免疫调节能力的抗菌融合蛋白。2.应用构建完成的bpi-ll37抗菌融合蛋白对间充质干细胞进行基因修饰,提高间充质干细胞的抗菌和毒素中和能力,以期获得具有杀菌、中和内毒素的抗菌型间充质干细胞。方法:通过pcr方法从bpi和ll-37基因的cdna中扩增并突变获得需要的rbpi21和ll37活性片断,构建rbpi21-ll37/ll37-rbpi21融合蛋白的表达载体,bpi蛋白质和ll-37蛋白质之间通过柔性片段(ggsgg)连接。之后将表达载体用瞬时转染方法导入模式细胞a549中。后通过westernblot检测a549细胞表达融合蛋白的情况,通过抑菌试验验证此融合蛋白的分泌与抗菌能力。融合蛋白构建成功后,将表达载体上的融合蛋白基因克隆至慢病毒载体中,并将其包装成为具有生物活性的慢病毒颗粒。再用慢病毒感染人脐带间充质干细胞,以完成对其的基因修饰。之后通过流式细胞术鉴定感染后的间充质干细胞的细胞表面标志,通过westernblot鉴定感染后的mscs中融合蛋白的表达情况,通过抑菌试验鉴定含有感染后的mscs外分泌物质的培养上清是否具有抗菌能力。结果:1.经限制性内切酶酶切、dna电泳和dna测序证实融合蛋白表达载体(plvx-bpi-ll-37)构建成功;westernblot检测结果表明融合蛋白rbpi21-ll37/ll37-rbpi21能被真核细胞a549细胞表达,融合蛋白大小介于25~30kda;抑菌试验进一步验证此融合蛋白具有抑制细菌生长的生物学效应。2.成功的分离并培养了人脐带间充质干细胞,对其的表面标志鉴定和诱导分化培养都符合相应标准。3.成功的包装了融合蛋白慢病毒颗粒,应用慢病毒感染完成了对间充质干细胞的基因修饰。流式细胞术显示被修饰的间充质干细胞具有正常的细胞表型,westernblot检测表明被修饰的间充质干细胞表达融合蛋白,且其培养上清具有抑菌能力。结论:1.构建的两种rbpi21-ll37/ll37-rbpi21表达载体能够成功转染入人的体细胞,并表达和分泌具有抗菌活性的融合蛋白。2.基因修饰后的间充质干细胞具有正常的干细胞表型,可以表达和分泌抗菌融合蛋白,含有其外分泌物质的培养上清具有抑菌能力。
【关键词】：脓毒症 间充质干细胞 基因修饰 抗菌蛋白 融合蛋白 杀菌/通透性增加蛋白 LL37
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 英文缩写对照表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 BPI-LL37/LL37-BPI融合蛋白表达载体的构建与功能鉴定13-37
• 2.1 材料与方法13-28
• 2.2 结果28-31
• 2.3 讨论31-37
• 第三章 抗菌型间充质干细胞的构建及功能鉴定37-52
• 3.1 材料与方法37-43
• 3.2 结果43-49
• 3.3 讨论49-52
• 全文总结52-53
• 问题与展望53-54
• 参考文献54-61
• 文献综述 干细胞移植治疗脓毒症研究进展61-70
• 参考文献67-70
• 攻读硕士研究生期间撰写及发表的论文70-71
• 致谢71

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本文编号：630912