组蛋白去乙酰化酶抑制剂对烫伤大鼠小肠肠屏障损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2017-08-13 13:11

  本文关键词：组蛋白去乙酰化酶抑制剂对烫伤大鼠小肠肠屏障损伤的保护作用及机制研究

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【摘要】：目的：以往研究表明，严重烧伤后组织缺氧能激活缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路，损害肠上皮屏障功能，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）能保护肠缺血引起的胃肠道屏障及远隔器官损害，但其具体的机制还不十分清楚，本研究假设HDACIs通过增加HIF-1乙酰化水平、抑制HIF-1功能，保护烫伤应激时肠上皮细胞的屏障功能。研究内容包括：1.采用大鼠50%TBSAⅢ度烫伤模型，研究腹腔内给予HDACIs能否减少HIF-1的表达，减轻肠屏障功能损害；2.通过肠上皮细胞低氧培养模型，研究HDACIs下调HIF-1、保护肠上皮屏障功能的可能机制。 方法： 1动物实验 动物分组：64只清洁级大鼠，体重240g-260g，购入后适应性饲养1周。术前12小时禁食，自由饮水。实验动物随机分为4组①假烫对照组（SC组）②烫伤组（SN组）③SAHA治疗烫伤组（SS组）④VPA治疗烫伤组（SV组）；每组根据观察时间点不同又分烫伤后3h（S3）和烫伤后6h（S6）两个亚组，（每个亚组n=8） 模型制作：取大鼠，，称重，标号，戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔内注射，麻醉成功后，备背部和腹部皮肤，假烫对照组大鼠置于37℃温水中，烫伤组大鼠置于100℃热水中，背部浸润15s，腹部浸润8s，假烫后在假烫对照组大鼠腹腔内注射生理盐水0.25ml，烫伤后在烫伤组大鼠腹腔内依次注射0.25ml生理盐水、SAHA(7.5mg/kg，溶于0.25ml生理盐水中)、丙戊酸钠(300mg/kg，溶于0.25ml生理盐水中)，分别在伤后3h和6h从腹主动脉取血标本、于回肠末端留取肠组织。 指标检测:①紫外分光光度计检测血清中二胺氧化酶(DAO)活性；②荧光显微镜观察免疫荧光双标法标记后的肠上皮细胞中ZO-1的变化；③用免疫印迹的方法测定肠组织中ZO-1和HIF-1α的含量；④运用多普勒血流仪监来测定肠黏膜血流量（IMBF）的变化； 2细胞实验 细胞分组：取冻存Caco-2细胞，快速复苏后进行培养细胞，将细胞随机分为四组①正常对照组（NC组）②缺氧组（H组）③SAHA治疗缺氧组(5uM)（HS组）④VPA治疗缺氧组（2mM）（HV组）； 模型制作:细胞融合达到95%以上时，分别用DMSO、Cocl2(1mM)+DMSO、 Cocl2(1mM)+SAHA (5uM)、 Cocl2(1mM)+VPA(2mM)+DMSO、刺激24h，24h后留取上清液，取胞浆液。 指标检测：①紫外分光光度计检测血清液中二胺氧化酶(DAO)活性；②用免疫印迹的方法测定胞浆中HIF-1α的含量；③免疫共沉淀方法检测胞浆中HIF-1α乙酰化水平 结果： 动物实验： 1血清中DAO活性：烫伤组DAO活性较假烫对照组明显升高，（P0.05），HDACIs治疗烫伤组较烫伤组明显降低，（P0.05），SAHA治疗烫伤组（SS组）较VPA治疗烫伤组（SV组）明显降低，（P0.05）。 2肠组织中紧密连接蛋白ZO-1：（1）免疫印迹法分析，与假烫对照组比较，烫伤组蛋白表达明显减少；HDACIs治疗烫伤组显著高于烫伤组，SAHA治疗烫伤组（SS组）较VPA治疗烫伤组（SV组）高；（2）观察免疫荧光，相比烫伤组，假烫对照组肠粘膜ZO-1呈阳性显示，荧光信号强，呈现出连续的状态；HDACIs治疗烫伤组荧光信号强于烫伤组（P 0.05），SAHA治疗烫伤组（SS组）荧光信号强于VPA治疗烫伤组（SV组）（,P 0.05）。 3HIF-1α Western blot：较假烫对照组，烫伤组HIF-1α表达显著增多（P0.05），而HDACIs治疗烫伤组低于烫伤组（P 0.05），SAHA治疗烫伤组（SS组）低于VPA治疗烫伤组（SV组），(P 0.05)。 4肠黏膜血流量：相比假烫对照组，烫伤组IMBF明显降低，（P 0.05），HDACIs治疗烫伤组较烫伤组明显升高，（P 0.05），SAHA治疗烫伤组（SS组）较VPA治疗烫伤组（SV组）明显上升，（P 0.05）。 细胞实验: 1上清液中DAO活性 缺氧组DAO活性相比空白对照组明显增大，（P 0.05），而HDACIs治疗缺氧组较缺氧组明显降低，（P0.05），SAHA治疗缺氧组较VPA治疗缺氧组明显降低，（P0.05）。 2HIF-1α Western blot：缺氧组HIF-1α蛋白水平较空白对照组显著升高（P0.05），而HDACIs治疗缺氧组HIF-1α蛋白水平较缺氧组较显著减少（P0.05）， SAHA治疗缺氧组较VPA治疗缺氧组显著减少（P0.05）。 3HIF-1α乙酰化水平：通过免疫共沉淀方法能够检测HIF-1α乙酰化水平，缺氧组HIF-1α乙酰化水平不明显， HDACIs治疗缺氧组HIF-1α乙酰化水平较缺氧组显著升高（P0.05）。 结论： 1HDACIs能抑制大鼠烫伤后肠上皮ZO-1的降解，降低肠上皮细胞通透性，保护肠屏障功能，SAHA的保护作用优于VPA。 2HDACIs能够增加HIF-1α乙酰化水平，减少HIF-1α的表达，保护肠屏障，这可能是HDACIs保护肠粘膜屏障的重要作用机制之一。
【关键词】：组蛋白去乙酰化酶抑制剂 烫伤 缺氧诱导因子-1 紧密连接蛋白ZO-1 肠屏障
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R644
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-13
• 第一部分 动物实验13-19
• 材料与方法13-17
• 结果17-18
• 结论18-19
• 第二部分 细胞实验19-35
• 引言19
• 材料与方法19-22
• 结果22-23
• 附图23-29
• 附表29-31
• 讨论31-34
• 结论34-35
• 参考文献35-38
• 综述 组蛋白去乙酰化酶抑制剂抗缺血缺氧的研究进展38-46
• 参考文献42-46
• 致谢46-47
• 个人简历47

【参考文献】

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1 陈秀凯 ,蒲践一 ,邱方 ,程爱国 ,刘刚;二胺氧化酶与D-乳酸对脑损伤大鼠肠屏障功能的监测意义[J];中国煤炭工业医学杂志;2003年07期

本文编号：667438