脑创伤后VEGI与创伤周围组织炎症反应的动物实验研究

发布时间：2017-08-24 08:36

  本文关键词：脑创伤后VEGI与创伤周围组织炎症反应的动物实验研究

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【摘要】：研究目的：脑创伤后颅内炎症反应促进继发性脑损伤的发展、脑水肿的形成、颅内压的增高、神经元的凋亡以及神经功能的缺失,显著恶化原发性损伤造成的危害。血管内皮生长抑制因子(vascular endothelial growth inhibitor,VEGI)是肿瘤坏死因子超家族成员,因其在多种疾病中具有重要作用而受到了广泛关注。VEGI除了具有抑制血管新生的作用外,还能调节炎症反应和抑制水肿的生成。本研究利用液压冲击法制作小鼠脑外伤模型,观察分析腹腔注射VEGI对小鼠颅脑损伤早期神经功能,血脑屏障,脑水肿的影响以及对脑组织局部炎症反应的调节作用,探索VEGI在脑外伤急性期是否具有神经保护作用。 研究方法：选用清洁级健康成年雄性C57BL/6小鼠共计180只,按照随机化原则分为假手术组(Sham组)、脑创伤后腹腔注射VEGI组(TBI+VEGI组)和脑创伤后腹腔注射VEGI溶媒组(TBI+Vehicle组)。分组后建立小鼠液压打击颅脑创伤模型,VEGI于伤后1小时、24小时、48小时经腹腔注射。应用改良神经功能评分法(mNSS)评价其行为学功能。TBI小鼠于伤后第1天和3天处死,应用干湿重法检测各组小鼠伤后脑组织含水量；应用伊文思蓝测定了各组小鼠伤后第3天的血脑屏障渗透率；应用免疫组织化学/免疫荧光组织化学染色观察脑创伤后第1天、3天激活的小胶质细胞和星形胶质细胞在创伤灶周围的变化情况。应用免疫组织化学染色方法观察各组实验小鼠的中性粒细胞在脑创伤后第1天、3天在脑创伤灶的浸润情况,应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组小鼠脑组织中细胞因子IL-1β和TNF-α变化。应用Tunel染色技术检测了各组小鼠海马神经细胞凋亡的变化情况。通过Morris水迷宫于各组小鼠伤后第7-12天进行认知功能评价。 研究结果：液压打击后,小鼠遭受创伤后mNSS即刻升高,TBI+VEGI组与TBI+Vehicle组伤后12小时组间评分无明显差异(P=0.136),伤后第1天,TBI+VEGI治疗组小鼠评分低于TBI+VehicIe组,并持续至伤后第7天,各时间点差异均有统计学意义(P0.05)。各创伤组小鼠脑组织HE染色均有TBI后典型病理变化。免疫荧光染色显示,伤后第1天,各组TBI小鼠创伤侧ED1+小胶质细胞大量激活,并于第3天时下降。TBI+VEGI组各时间点ED1+小胶质细胞数量低于TBI+Vehicle组,差异有统计学意义(P0.05)。免疫组化显示：伤后第1天,各组TBI小鼠创伤侧GFAP+星形胶质细胞大量激活,第3天时数量下降,TBI+VEGI组各时间点GFAP+星形胶质细胞数量低于TBI+Vehicle组,差异有统计学意义(P0.05)。应用ELISA检测技术观察创伤侧的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α浓度发现：在伤后第1天和3天,各组TBI小鼠创伤侧IL-1β和TNF-α水平均高于Sham组,TBI+VEGI组各时间点IL-1β和TNF-α的水平低于TBI+Vehicle组(P0.05)。干湿重观察发现：在伤后第1天和3天,与Sham组相比,TBI+VEGI组和TBI+Vehicle组脑水含量均明显增加；TBI+VEGI组在1天和3天脑组织的水含量明显低于TBI+Vehicle组,各时间点差异均有统计学意义(P0.05)。伊文思蓝渗透率实验发现：伤后第3天,TBI+VEGI组小鼠血脑屏障渗透率低于TBI+Vehicle组(P0.05)。免疫组化染色显示,在伤后第1天,各组TBI小鼠创伤灶周围有大量中性粒细胞聚集,并于第3天达到高峰。TBI+VEGI组小鼠脑组织中MPO+中性粒细胞数目在伤后第1天、第3天明显低于TBI+Vehicle组(P0.05)。Tunel染色观察小鼠脑创伤后神经细胞的凋亡情况发现：伤后第3天,TBI+VEGI组脑创伤周围神经元的凋亡数目明显低于TBI+Vehicle组(P0.05)。Morris水迷宫实验示,随着观察时间延长,不同处理组小鼠认知功能逐渐恢复。与TBI+Vehicle组比较,VEGI治疗组小鼠训练第1天认知功能无明显改善(P=0.612)。但从第2天开始,处理组小鼠逃避潜伏期缩短,并维持至训练结束,差异有统计学意义(P0.05)。第12天时,VEGI治疗组小鼠目标象限所占时间百分率明显高于TBI+Vehicle组(P0.05)。 研究结论：VEGI能够有效抑制小鼠颅脑创伤急性期脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,降低脑内促炎因子IL-1β和TNF-α的水平,从而减轻脑水肿和血脑屏障渗漏,减少中性粒细胞的浸润和神经元的凋亡,改善TBI小鼠的神经功能和空间学习能力。VEGI可能成为TBI急性期治疗的新途径。
【关键词】：血管内皮细胞生长抑制因子 创伤性脑损伤 免疫 炎症 脑水肿
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-13
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 对象和方法13-33
• 1. 实验材料13-17
• 1.1 实验动物13
• 1.2 实验仪器13-16
• 1.3 实验试剂16-17
• 2. 实验方法17-32
• 2.1 小鼠液压打击模型制备17-19
• 2.2 rhVEGI-192 注射19
• 2.3 mNSS评价小鼠伤后行为学损害19-21
• 2.4 小鼠脑组织切片的制备21-24
• 2.5 脑组织石蜡切片HE染色24
• 2.6 脑组织切片免疫组化染色24-26
• 2.7 冰冻切片的免疫组化26-27
• 2.8 冰冻切片的免疫荧光27
• 2.9 Tunel染色27-28
• 2.10 小鼠脑水含量测定(干湿重法)28-29
• 2.11 测定小鼠脑损伤后EB渗透率29
• 2.12 ELISA检测炎症因子IL-1β,TNF-α的表达29-31
• 2.13 Morris水迷宫检测空间学习记忆能力31-32
• 3. 统计学分析方法32-33
• 结果33-45
• 1. 小鼠脑组织形态学观察33
• 2. 各组小鼠TBI后,ED1~+小胶质细胞在脑组织中的激活情况33-35
• 3. 各组小鼠TBI后,GFAP~+星形胶质细胞在脑组织中的激活情况35-36
• 4. 各组小鼠TBI后,脑组织中促炎细胞因子的变化情况36-37
• 5. 各组小鼠脑水含量测定37-38
• 6. VEGI治疗后小鼠血脑屏障渗透率变化38-39
• 7. 各组小鼠外周血中性粒细胞向创伤区浸润情况39-40
• 8. 脑创伤后各组小鼠海马区凋亡细胞数比较40-41
• 9. mNSS评分评估小鼠行为学功能变化41-42
• 10. Morris水迷宫进行认知功能评价42-45
• 讨论45-50
• 1. 脑外伤后脑内炎症细胞的激活45-46
• 2. 血源性中性粒细胞的浸润加剧脑损伤46-47
• 3. VEGI减少了TBI急性期小胶质细胞和星形胶质细胞的激活47-48
• 4. VEGI减少了TBI急性期血脑屏障的渗漏和中性粒细胞的浸润48
• 5. VEGI在TBI急性期发挥脑保护作用48-50
• 结论50-51
• 参考文献51-56
• 发表论文和参加科研情况说明56-57
• 综述 血管内皮细胞生长抑制因子的研究进展57-68
• 综述参考文献63-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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中国博士学位论文全文数据库 前1条

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本文编号：730292