PTEN干扰促进肺泡巨噬细胞炎症因子的表达

发布时间：2017-09-02 03:24

  本文关键词：PTEN干扰促进肺泡巨噬细胞炎症因子的表达

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【摘要】：目的:观察转染PTEN干扰RNA(PTEN siRNA)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响,探讨PTEN对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用及可能机制。方法:1.体外培养NR8383,将细胞分成两组:对照组转染Control siRNA,干扰组转染PTEN si RNA,分别选取10nM、20nM、40nM浓度转染24小时,采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测转染后两组细胞中PTEN mRNA表达,采用蛋白质印迹法(western blot)检测转染后两组细胞内PTEN蛋白表达。优化转染条件,选择20nM为最佳实验转染浓度。2.将NR8383细胞分成两组:对照组转染Control siRNA,干扰组转染PTEN si RNA,转染24小时后,两组细胞分别用终浓度1μg/ml LPS刺激细胞6小时,采用RT-qPCR检测两组细胞内TNF-αmRNA表达,采用western blot检测两组细胞内AKT磷酸化水平,采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测两组细胞培养上清液中TNF-α蛋白的表达变化。结果:1.与对照组比较,10nM、20nM和40nM干扰组PTEN mRNA表达分别下调至(0.33±0.01)倍(P0.01)、(0.23±0.01)倍(P0.01)、(0.21±0.01)倍(P0.01);PTEN蛋白表达分别下降至(0.30±0.03)倍(P0.01)、(0.14±0.02)倍(P0.01)、(0.10±0.02)倍(P0.01);在干扰组中,与10nM浓度比较,20nM、40nM浓度PTEN蛋白表达有统计学差异(P0.01)。20nM与40nM浓度比较,PTEN蛋白表达差异无统计学意义(P=0.08)。2.两组细胞LPS刺激6小时后,与对照组比较,p-AKT/AKT蛋白比值从(0.26±0.02)表达上升至(0.52±0.03)倍(P0.01),干扰组细胞中TNF-αmRNA表达上调至(1.56±0.18)倍(P0.01)。Control si RNA+LPS对照组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1632.56±52.05pg/ml,PTEN siRNA+LPS干扰组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1834.07±57.00pg/ml(P0.05)。结论:转染PTEN si RNA入NR8383细胞后,可上调AKT磷酸化水平,促进LPS诱导肺泡巨噬细胞TNF-α的表达。因此,我们推测PTEN可能通过PI3K-AKT通路参与调控LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。
【关键词】：PTEN 干扰RNA 磷酸化AKT 肺泡巨噬细胞 肿瘤坏死因子-α
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-15
• 第2章 材料与方法15-32
• 2.1 实验材料15-17
• 2.1.1 细胞株15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.1.3 主要仪器与设备16-17
• 2.2 实验器材、试剂和溶液的准备17-20
• 2.2.1 细胞培养用品的处理17-18
• 2.2.2 去RNA酶处理18
• 2.2.3 Ham’s F-12K培养基的配制18
• 2.2.4 LPS溶液的配制18
• 2.2.5 PTEN si RNA及Control siRNA相关试剂的配制18-19
• 2.2.6 Western Blot相关试剂的配制19-20
• 2.3 实验方法20-32
• 2.3.1 NR8383的复苏、培养、传代和冻存20
• 2.3.2 细胞处理及分组20-21
• 2.3.3 RNA提取、定量和质量检测21-23
• 2.3.4 SYBR Green I实时荧光定量PCR检测PTEN m RNA及TNF-αmRNA的表达23-25
• 2.3.5 Western blot检测PTEN、p-AKT蛋白的表达变化25-28
• 2.3.6 ELISA检测上清中TNF-α蛋白的表达28-31
• 2.3.7 统计学处理31-32
• 第3章 结果32-39
• 3.1 细胞总RNA质量和浓度测定32
• 3.2 RT-qPCR扩增的特异性32-34
• 3.3 BCA蛋白定量34
• 3.4 SYBR Green I Real-Time qPCR检测转染PTEN siRNA、Control siRNA后细胞内PTEN mRNA表达变化，，选择最佳转染浓度34-35
• 3.5 Western blot检测转染PTEN siRNA、Control si RNA后细胞内PTEN蛋白表达变化，选择最佳转染浓度35-36
• 3.6 下调PTEN对NR8383细胞靶蛋白AKT磷酸化水平的影响36
• 3.7 下调PTEN后对NR8383细胞TNF-α mRNA相对表达的影响36-37
• 3.8 大鼠TNF-α蛋白标准曲线图37
• 3.9 下调PTEN后对NR8383细胞上清液中TNF-α蛋白表达的影响37-39
• 第4章 讨论39-43
• 第5章 结论与展望43-44
• 5.1 结论43
• 5.2 进一步工作的方向43-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-49
• 攻读学位期间的研究成果49-50
• 综述50-56
• 参考文献54-56

【参考文献】

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本文编号：776108