烧伤对成年大鼠认知功能损害和海马区S100β表达的研究

发布时间：2017-09-04 05:12

  本文关键词：烧伤对成年大鼠认知功能损害和海马区S100β表达的研究

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【摘要】：目的： 谵妄是一种急性非特异性实质脑器官的功能紊乱。大面积烧伤可导致谵妄的发生，烧伤合并谵妄患者死亡率增加、愈后质量差。但烧伤所致谵妄的机制尚不清楚，并且对于谵妄的诊断尚无确切的生物学指标。目前，临床上仅能依据精神疾病量表、脑电图粗略地判断患者的谵妄状态等。由于这些方法存在客观性、准确性等方面的缺陷，无法对谵妄的预防和发展进行有效干预、对严重程度进行客观地评估。因此本论文通过对大面积烧伤成年大鼠认知功能损害的观测，探讨海马S100β蛋白与认知障碍相关性，旨在为烧伤谵妄，提供客观准确、方便快捷的诊断依据，从而提高患者愈后质量。 方法： 实验动物均雄性健康成年Wistar大鼠，鼠龄90天，体重280-300g，由吉林大学动物实验中心提供。室温为20℃，昼夜周期12小时更替，给予充足食水。所有大鼠均在上述环境下饲养7天。 一、成年大鼠大面积Ⅲ度烧伤模型建立 Wistar大鼠将铜块置于水浴锅（95-100℃）1分钟，并接触鼠背皮肤持续30秒（如图3.2）。HE染色检测大鼠背部皮肤组织学改变，该烧伤深度累及全层皮肤，并且皮肤附属器遭到破坏。（如图3.3）即大鼠鼠背烧伤程度为Ⅲ度。 大鼠随机分空白对照组（8只），烧伤组（分为烧伤后1d、3d、5d、7d、14d、21d每组各8只）。 烧伤组Wistar大鼠具体实施步骤：将铜块置于水浴锅（95-100℃）1分钟，并接触鼠背皮肤持续30秒。随后，依据Parkland补液公式给予烫伤鼠乳酸林格氏液腹腔注射，进行液体复苏，并置于恒温毯（38-40℃）中进行保温，大鼠恢复自主活动，，即造模完成。 空白对照组Wistar大鼠不施以热力损伤。给予相同饲养和处置环境，以保证实验条件的一致性。 二、空间学习、认知能力—Morris水迷宫 该装置为一个径为150cm水深50cm的圆形黑色水槽（水温20-22℃），一个黑色平台置于直水平面下1.0cm，水槽四周设立不变标志物，保证从实验开始至结束水槽外周环境因素恒定不变，大鼠根据该标志物确定找到平台的游行路线。大鼠在烧伤前五天进行水迷宫训练，每日一次。根据实验规定，将水槽等分为四个象限，将大鼠置于与平台所在象限的对立象限，大鼠面对水槽壁，然后放入该象限中，自由游泳120s，或大鼠找到平台，该大鼠实验终止，若120s内大鼠未到达平台，则引导其找到平台，并且在平台上驻足3s，以便于观察周围环境，上述实验往复进行。（如图3.4） 第5日训练完毕后，将空白对照组及烧伤组（1d、3d、5d、7d、14d、21d各8只大鼠）重复水迷宫实验，测定各组能否记忆平台的位置。垂直水槽上方的摄像头观察和记录大鼠游泳的速度、到达平台所用的时间以及大鼠游行路线。 三、S100β蛋白ELISA实验 1、S100β蛋白提取 ①称重：大鼠海马样本天平称重，按照100mg/1ml加入裂解液 ②匀浆：将组织样本切碎，加入匀浆器，再加入1ml裂解液，反复抽提25-30次，于冰上进行，匀浆完毕在冰上裂解30min。 ③离心：利用低温离心机，1000g4℃离心10min。 ④振荡：沉淀加入100-150ul含有PMSF裂解液，超声震荡3秒，3次 ⑤再离心：取上清再次离心12000r4℃10min后取上清，提取蛋白。 2、S100β蛋白ELISA测定 ①包被过程 ②封闭酶标反应孔 ③加入待检测样品 ④加入酶标抗体 ⑤加入底物液 ⑥终止反应 ⑦结果判断 3、观察 4、统计学方法： 结果： 一、Morris水迷宫路线图 1、前5日成年大鼠Morris训练图 第1日，大鼠Morris水迷宫路线图，大鼠沿着水槽内壁游行，在120s实验期间并未成功踏上平台（如图3.5）。第3日，大鼠Morris水迷宫路线图，大鼠沿着水槽内壁和水槽内部游行，在120s实验期间内成功踏上平台（如图3.6）。第4日，大鼠Morris水迷宫路线图，大鼠很少沿着水槽内壁游行，且路线较规整，在120s实验期间并成功踏上平台（如图3.7）。第5日，大鼠Morris水迷宫路线图，大鼠游行线路交之前规整，在120s实验期间并成功踏上平台（如图3.8）。 2、空白对照组大鼠Morris训练图 第1、3、5、7、14、21日，大鼠Morris水迷宫路线图，大鼠几乎径直游行到平台，成功踏上平台（如图3.9、如图3.16） 3、烧伤实验组大鼠Morris训练图 第1、3、5、7、14、21日，大鼠Morris水迷宫路线图，大鼠游行路线逐渐变为复杂，游行方式由径直转向沿壁，由成功登上平台到120s未完成实验（如图3.10-3.15） 二、空白对照组和实验组大鼠游行速度、游行距离以及到达平台时间 利用Morris水迷宫系统记录和观察，游行的距离（见表3.1）、达平台的时间（见表3.2）和速度（见表3.3）。游行路程上看，当烧伤干预之后大鼠游行的路程有着明显的升高，随后又有所回落（如图3.18、3.20），游行时间来无论是最大值、最小值和平均值实验组都要比对照组所花费的时间要多（如图3.19），从大鼠的游行速度角度来看，每组大鼠的游行速度是成上下波动的，没有明显的组间特征，烧伤干预并没有明显的效果，且组数据并没有统计学意义（如图3.21）。 三、烧伤对大鼠海马区S100β表达的影响 本实验探讨成年大鼠在烧伤单因素后神经系统S100β表达差异，本实验利用ELISA技术检测海马区S100β蛋白表达情况。测定蛋白浓度后得知，大鼠烧伤后第1日-第21日，S100β蛋白浓度依次为1.008ng/ml、1.269ng/ml、2.220ng/ml、3.320ng/ml、4.650ng/ml、6.933ng/ml，大鼠烧伤后时间与S100β蛋白浓度成正相关性（如图3.22）。 缘于烧伤对大鼠刺激程度较大，在实验过程中出现部分大鼠死亡的个例，为保证实验试验样本数量一致性，新增添实验大鼠均按照总技术路线图（如图3.25），完成实验一和实验二相应实验，以保证实验数据可靠性。 结论： 1.烧伤导致的谵妄是持续中枢神经系统损伤引起的认知功能障碍。 2.大面积烧伤引起中枢神经系统损害。 3. S100β可作为烧伤谵妄客观的评估指标。
【关键词】：大面积烧伤 谵妄机制 钙结合蛋白S100β Morris水迷宫
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R644
【目录】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-14
• 中英文缩略词14-15
• 第1章 绪论15-18
• 第2章 综述18-31
• 2.1 前言18
• 2.2 谵妄的分类18-19
• 2.3 烧伤后谵妄的流行病学和风险因素19-20
• 2.4 烧伤谵妄的机制20-24
• 2.4.1 胆碱能系统缺陷机制20-21
• 2.4.2 应激机制21-23
• 2.4.3 炎性反应23-24
• 2.5 烧伤谵妄诊断24-28
• 2.5.1 量表评估24-26
• 2.5.2 生物标志物诊断26-28
• 2.5.3 脑电图诊断谵妄28
• 2.6 烧伤谵妄的治疗28-30
• 2.6.1 非药理学方法对谵妄的防治28-29
• 2.6.2 药理学方法对谵妄的治疗29-30
• 2.6.3 谵妄不同亚型的治疗30
• 2.7 存在问题与展望30-31
• 第3章 实验研究31-44
• 3.1 实验一：大面积烧伤对成年鼠认知功能的影响31-40
• 3.1.1 材料与方法31-34
• 3.1.2 实验结果34-40
• 3.1.3 结论40
• 3.2 实验二：大面积烧伤对大鼠海马区 S100β表达影响40-44
• 3.2.1 材料与方法40-43
• 3.2.2 实验结果43
• 3.2.3 结论43-44
• 第4章 讨论44-50
• 第5章 结论50-51
• 参考文献51-59
• 致谢59-60
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果60

【参考文献】

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1 冯世杰，花兰女，金曙雯，严忠馥，赵雁飞，朱清如;大鼠烫伤模型的制作[J];上海第二医科大学学报;1995年03期

2 蓝海珍;于布为;;术后谵妄的研究进展[J];上海医学;2013年02期

本文编号：789529