亚低温对颅脑创伤微环境下温敏脐带间充质干细胞分化特性影响的研究

发布时间：2017-09-07 22:54

  本文关键词：亚低温对颅脑创伤微环境下温敏脐带间充质干细胞分化特性影响的研究

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【摘要】：目的:从物理和化学微环境的角度探讨亚低温对颅脑损伤(TBI)后移植温敏脐带间充质干细胞(ts UC)分化特性的影响。方法:1温敏脐带间充质干细胞的建立、培养:从新生儿脐带中分离培养脐带间充质干细胞(UC);通过感染携温度敏感型猿猴病毒40大T抗原(ts-SV40LT)基因的逆转录病毒来制备ts UC,并于正常培养温度(NT,37℃)和亚低温(MHT,33℃)条件下分别培养。2模拟脑组织弹性模量制备二维培养基质:利用单丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合作用,按不同浓度配比制备出不同弹性模量的聚丙烯酰胺(PA)水凝胶;应用力学试验机拉伸检测水凝胶的弹性,并筛选出类似于脑组织和颅脑损伤后脑组织(近似于肌肉组织)弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶;按相应的浓度配比,制备模拟脑组织和肌肉组织弹性模量的二维培养基质。3亚低温(MHT)对正常脑组织及TBI脑组织物理微环境下ts UC的影响:实验分为5组:对照组(Sham组)、UC+NT+0.5k Pa组、ts UC+MHT+0.5k Pa组、UC+NT+8.0k Pa组、ts UC+MHT+8.0k Pa组。其中Sham组为玻片上常规培养UC,其余4组分别按细胞种类、培养基弹性模量及培养温度区分。动态观察各组细胞的生长情况和形态变化,7天后行免疫荧光检测各组细胞的分化水平,对于分化的神经元用Image J软件计算其轴突长度。4亚低温后TBI脑组织化学微环境对UC的影响:应用电子脑皮质挫伤撞击仪制作大鼠TBI模型,给予全身亚低温处理4 h后,获取大鼠模型损伤区域脑组织的提取液,同样获得单纯TBI及假手术组大鼠的脑组织提取液。模拟脑组织弹性模量制备聚丙烯酰胺水凝胶,将分离培养的UC置于上述水凝胶上培养,分别加入三种大鼠的脑组织匀浆液,由此分为UC+Sham、UC+TBI、UC+TBI+MHT三组,24 h后检测各组细胞的凋亡水平,并更换为UC的正常培养基。7天后行细胞免疫荧光检测其向神经元分化的水平。5亚低温联合ts UC移植对TBI大鼠神经功能的修复:将SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、注射PBS组(TBI+PBS组)、温敏脐带间充质干细胞移植组(TBI+ts UC组)、亚低温+温敏脐带间充质干细胞移植组(TBI+MHT+ts UC组),除Sham组和TBI+PBS组外,均采用立体定向技术将预先行Brd U标记的干细胞注射到损伤处脑组织周围(TBI+PBS组注射等量PBS),其中TBI+MHT+ts UC组的大鼠在造模完成后立即行亚低温治疗,待体温降至33℃后行干细胞移植。伤后第3天采用干湿比重法测定脑组织含水量,伤后24小时、3天、7天分别行神经学缺损评分,7天后脑组织取材测定损伤体积,并行细胞免疫荧光评价移植干细胞的存活情况。结果:1 UC和ts UC的培养和鉴定结果:UC的流式细胞分析检测结果显示,细胞表面抗原的表达符合UC的特征,UC细胞的纯度为97.91%,生长、增殖活性较强。经转染携ts-SV40LT基因慢病毒的UC,其生长曲线及细胞蛋白表达均符合ts UC的特性。2以PA水凝胶为基础的细胞培养基质:通过力学试验机的测量及筛检,最终得到弹性模量近似于脑组织和颅脑损伤后脑组织的PA水凝胶弹性模量检测结果,分别为0.5±0.03 k Pa和8.0±0.11 k Pa。按相应比例于盖玻片上配制出相应弹性模量的培养基。3不同弹性模量水凝胶上干细胞的形态变化:相差显微镜下显示,UC+NT+0.5k Pa组、ts UC+MHT+0.5k Pa组部分细胞出现细长的胞突,形态上类似于神经元;而UC+NT+8.0k Pa组、ts UC+MHT+8.0k Pa组部分细胞呈长梭形生长,类似于肌细胞;Sham组细胞无明显形态变化。4不同弹性模量水凝胶上干细胞的免疫荧光结果:细胞免疫荧光结果显示,仅UC+NT+0.5k Pa组、ts UC+MHT+0.5k Pa组有少量神经元阳性表达的细胞,与其余3组相比差异均具有统计学意义(*P0.01);而UC+NT+0.5k Pa组、ts UC+MHT+0.5k Pa二者相比,神经元分化率及神经元轴突长度均无明显差异(#P0.05)。5不同脑组织提取物干预作用下干细胞的凋亡水平和细胞免疫荧光结果:与UC+Sham组相比,24 h后UC+TBI组的凋亡细胞明显增多(*P0.01),而UC+TBI+MHT组可显著逆转TBI组诱导的凋亡细胞增多,二组相比差异具有统计学意义(*P0.01);7天后的细胞免疫荧光结果显示,与UC+TBI组相比,UC+TBI+MHT组UC的神经元分化率亦明显增高(*P0.01)。6大鼠脑水肿程度与神经学缺损评分:伤后第3天,TBI+ts UC+MHT组大鼠的脑组织水肿程度明显降低,与TBI+PBS组、TBI+ts UC组相比,差异有统计学意义(*P0.05,#P0.05);伤后3天,TBI+PBS组、TBI+ts UC组和TBI+ts UC+MHT组大鼠神经学缺损评分较第1天相应降低(aP0.05),伤后7天,TBI+PBS组、TBI+ts UC组和TBI+ts UC+MHT组大鼠神经学缺损评分较第3天相应降低(bP0.05);伤后3天、7天,TBI+ts UC+MHT组大鼠的神经学缺损评分明显较低,与TBI+PBS组和TBI+ts UC组相比,差异均具有统计学意义(cP0.05,dP0.05)。7大鼠脑组织损伤体积测定结果:TBI+ts UC+MHT组大鼠的脑组织损伤体积明显小于TBI+PBS组、TBI+ts UC组,差异有统计学意义(*P0.05,#P0.05)。8大鼠脑组织移植细胞存活及增殖情况:免疫荧光结果显示,TBI+ts UC+MHT组移植干细胞的存活量明显多于TBI+ts UC组,差异具有统计学意义(*P0.05)。结论:1亚低温联合ts UC与常温下UC的分化能力相似,在模拟脑组织弹性模量的培养基中均可向神经元分化,而在模拟TBI脑组织弹性模量的培养基中则无分化为神经元的能力。2亚低温可改善TBI脑组织的高张物理微环境,从而提高移植ts UC的存活与分化能力,并促进神经功能恢复。3亚低温治疗可改善损伤后的脑组织的化学微环境,减少移植UC的凋亡,并使其分化能力得到一定恢复。
【关键词】：亚低温 颅脑损创伤 物理微环境 化学微环境 温敏脐带间充质干细胞 弹性模量 脑组织提取液
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文缩写12-13
• 前言13
• 材料与方法13-29
• 结果29-32
• 附图32-43
• 附表43-45
• 讨论45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 综述 基于生物力学的干细胞调控及相关物理性质的测定52-60
• 参考文献57-60
• 致谢60-61
• 个人简历61

【参考文献】

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1 李晓红;陈，

本文编号：810376