二羟黄酮对中度创伤性脑损伤后小鼠皮层神经元树突的保护

发布时间：2017-09-19 03:06

  本文关键词：二羟黄酮对中度创伤性脑损伤后小鼠皮层神经元树突的保护

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【摘要】：背景：创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是一个常见的外伤性疾病,也是一个严重的公共健康问题。它除了对脑造成直接机械损伤外(primary injury),还可导致二次损伤(secondary injury),包括细胞死亡,退行性病变等。神经元树突退行性病变属于二次损伤中的一个方面,研究显示即使是无可见外伤的轻度脑损伤依然存在神经元树突的退行性病变现象,这种病变有可能导致永久性的认知、情感障碍以及运动功能损伤。各种针对脑损伤的治疗正在探索中,神经营养因子也是其中一种。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族的成员,它作用于中枢及外周神经系统的某些神经元,对于神经元的存活,新生神经元的分化以及突触的形成都有促进作用。但因分子量太大、半衰期短,容易引起免疫反应等问题在治疗应用上有很大的局限性。因此,我们需要一种替代品,它既能有与BDNF相似的作用,而且还需要具备以下优势：分子量小,能通过血脑屏障,可以经过腹腔注射或者静脉注射给药,以及不容易引起免疫反应。在其他人发表的文章中,提到了一种小分子化合物——二羟黄酮。二羟黄酮是黄酮家族的成员之一,且具有一些独特的优势；分子量小,能通过血脑屏障,能激活络氨酸激酶受体磷酸化,已被证实在缺血损伤模型中对损伤大脑具有保护作用。因此,我们想观察二羟黄酮是否对创伤性脑损伤后的皮层具有神经保护作用。 方法：课题采用9-10周龄的C57BL/6雄性小鼠,对其进行可控性皮层撞击模型,将小鼠麻醉、固定、消毒后剪开头顶部皮肤,以前囟和后囟的连线、中缝和颞肌连线的交点为圆心,2mm为半径用牙科钻钻一个圈,在不伤及硬脑膜的前提下小心揭开颅帽；调整撞击杆位置使其位于钻开的圆圈正中,并接触面垂直,设置速度为3m/s,深度为1.Omm,停留时间为0.1s,此条件下的撞击即可造成中度创伤性脑损伤,非手术组仅摘去颅帽,并不对皮层进行撞击；小鼠被随机分成4组,分别为非手术组、手术组、治疗组和实验对照组,每组4只。造模后,分别于1小时,24小时,48小时,72小时给予治疗组小鼠腹腔注射二羟黄酮,由于二羟黄酮是以二甲基亚砜作为溶剂,而二甲基亚砜也被报道具有一定的神经保护作用,因此我们给另一组小鼠注射二甲基亚砜作为实验对照组；最后一次注射24小时后,取出小鼠的大脑,高尔基染色预处理后,用滑动切片机切片,切片厚度为200μm；切片用高尔基染色法染色并在显微镜下观察拍照,选取皮层损伤区域边缘起2mm区域,对皮层Ⅱ、Ⅲ层所有锥体神经元树突上串珠样改变、树突分支、树突棘数目等进行计数；另一方面,从行为学上检测二羟黄酮对脑损伤模型小鼠的作用。共计90只小鼠被随机分配成4个组,每组15到24只,滚筒实验分别在术前一天、术后三天、术后七天、术后十四天进行,记录小鼠在滚筒上停留的时间用于评估小鼠损伤后的运动功能；术后第三周,对小鼠进行为期6天的Morris水迷宫试验,包括5天的学习评估和最后1天的记忆评估,记录找到平台的时间、游泳速度、最后一天在平台所在象限停留的时间等指标用于评估小鼠损伤后的学习记忆功能。 结果： 1、二羟黄酮对损伤后皮层神经元树突串珠样改变的影响：在创伤性脑损伤后,皮层的锥体神经元受到了损伤,不仅仅是单纯的细胞死亡,存活下来的神经元也受到了影响,出现了树突串珠样改变。但是在治疗组,串珠样改变的程度明显减轻。计数结果表明,对照组仅有少量的串珠样改变(19.78±3.7/mm),而手术组的小鼠串珠样改变数目明显增多(37.58±3.19/mmm),接近于对照组的两倍。治疗组小鼠的串珠样改变比起手术组小鼠显著减少,只有前者的1/2左右(19.23±2.05/mm),而实验对照组的串珠样改变数目则比治疗组多了一倍以上(43.31±4.06/mm)。 2、二羟黄酮对损伤后皮层神经元树突分支的影响：分析结果显示,顶树突中,非手术组的锥体神经元树突分支数为6.46±0.4,树突总长度为684.36±39.29μm,平均分支长度为111.28±4.12μm。损伤后,手术组的锥体神经元树突分支比非手术组减少(4.92±0.49),树突总长度比非手术组短(475.67±32.27μm)。治疗组的锥体神经元树突分支比手术组显著增多,甚至比非手术组也有所增多(7.39±0.57),树突总长度显著增长(794.54±58.79μm)。实验对照组的树突分支比对照组减少,比手术组也轻微减少(4.29±0.3),树突总长度也比非手术组短(557.92±29.24)但比手术组稍长。 在基底树突中,手术组的树突分支(5.68±0.36)比非手术组(7.57±0.42)少,树突总长度(373.31±31.21μm)比非手术组(539.71±36.64μm)短。治疗组树突分支(7.63±0.55)比手术组增多,树突总长度(637.52±52.8μm)也比手术组长,实验对照组的树突分支(5.10±0.25)比非手术组短,树突总长度(387.02±26.15μm)也比非手术组短。 3、二羟黄酮对损伤后皮层神经元树突形态的影响：损伤后,神经元树突的形态在树突中部和远端均受到了影响。在顶树突,手术组树突交点(2.3±0.23)比非手术组(3.01±0.19)减少；治疗组树突的交点(3.05±0.24)比手术组多,甚至在胞体中部的区域比非手术组小鼠多；实验对照组(2.39±0.19)与手术组接近,树突交点甚至在远离胞体的区域比手术组小鼠少。在基树突,手术组交点(4.17±0.29)少于非手术组(5.27±0.29),治疗组比手术组可见更多的交点(5.47±0.49)而实验对照组与手术组无明显差异(4.03±0.23)。 4、二羟黄酮对损伤后皮层神经元树突棘的影响：在中度创伤性脑损伤后,树突不光发生串珠样改变和复杂性减弱,同时其上的树突棘数量也在减少。我们把2mm区域划分成4个亚区域,每个区域包括0.5mm。在0-0.5mm区域,所有接受了造模手术的小鼠(损伤组：44.96±1.82/100μm；治疗组：44.64±2.38/100μm；实验对照组：44.66±4.47/100μm),其树突棘的数量都比非手术小鼠明显减少(54.62±2.96/100μm)。在0.5-1.0mm区域,非手术组树突棘未见明显变化(57.54±2.33/100μm),手术组小鼠树突棘数量也无明显变化(47.21±2.93/100μm),治疗组小鼠的树突棘却比前一区域大幅增加(56.32±6.93/100μm),实验对照组的树突棘不仅没有回升,反而有少量的减少(39.95±3.11/100μm)。1.0-1.5mm区域里,非手术组(53.86±356/100μm)和手术组(43.608±3.39/100μm)的树突棘没有明显波动,而治疗组树突棘则继续增加(60.25±4.55/100μm),实验对照组则有少量增加(44.79±4.39/100μm)。1.5-2.0mm区域,手术组小鼠的树突棘可见较之前的区域明显增加(53.46±3.31/100μm),且与非手术组(58.99±3.81/100μm)接近,治疗组增加的趋势减缓,此时已经超过了非手术组(66.95±5.54/100μm)。实验对照组也在这个区域数量接近了非手术组(52.38±3.97/100μm)。 5、二羟黄酮对不同形态的树突棘的影响：树突棘根据大小和头颈形态大体分为了三类：蕈形树突棘(头部较大颈部细长)、短粗形树突棘(没有明显的头颈结构)和细长型树突棘(头部较小颈部细长),而且研究发现这三种形态是动态的,连续的,属于不同的发育阶段。中度创伤性脑损伤后,手术组小鼠蕈形树突棘数量显著减少(14.12±0.98/100μm),直到远离损伤中心的区域才恢复,治疗组小鼠在靠近损伤中心的区域较非手术组大幅减少(15.22±1.1/100μm),但是从0.5-1.0mm区域开始就开始回升(19.03±3.02/100μm),并且数量随着远离损伤中心持续增长。实验对照组与手术组接近,在靠近损伤中心的区域蕈形树突棘比非手术组显著减少,直到远离损伤中心的区域才恢复到接近非手术组的水平；手术组短粗形树突棘在稍微远离损伤的区域(21.97±1.91/100μm)比靠近损伤的区域(23.79±1.33/100μm)受损更为显著,但是在距离更远的区域会出现大幅度的回升(28.00±1.98/100μm)；治疗组的短粗形树突棘在靠近损伤的区域受损不显著(21.91±1.65/100μm),但随着离损伤中心距离增加,树突棘密度也会持续上升(30.93±1.82/100μm),甚至优于非手术组(24.49±1.66/100μm)；实验对照组也是在距离损伤中心稍远的区域树突棘密度明显减少(18.62±2.18/100μm),但是在更远的区域密度又大幅回升(24.80±1.54/100μm)；手术组细长形树突棘从靠近距离损伤中心的区域就受到了损伤(损伤组：7.06±0.97/100μm；非手术组：11.36±1.87/100μm),但是在稍远的区域出现较明显的回升(10.85±1.32/100μm),随着距离的增加又会回落至较低的水平(9.86±1.18/100μm)；治疗组密度在靠近损伤中心的区域也受到了影响(7.52±1.46/100μm),与手术组非常接近,但是随着距离的增加密度在持续上升直至与非手术组接近(治疗组：14.17±1.70/100μm；非手术组：14.86±1.69/100μm)；实验对照组的密度在靠近损伤中心的区域与手术组相似(8.59±1.59/100μm),但是在稍远的区域密度没有见到明显的回升,相反密度出现了轻微的下降(0.5-1.0mm:7.65±1.27/100μm；1.0-1.5mm:7.81±1.16/100μm),直到较远区域才回升到接近手术组的水平(10.01±1.16/100μm)。 6、二羟黄酮在不同深度对损伤后皮层神经元树突棘的影响：前述实验已证明二羟黄酮的保护作用有广度的限制,为了进一步了解其在深度上是否也有限制,我们将Ⅱ、Ⅲ层神经元树突划分为两个深度区域。在0-200μm深度区域,0-0.5mm的区域,手术组树突棘总密度减少(非手术组：61.08±2.97/100μm；手术组：50.97±1.83/100μm),治疗组的树突棘总密度(45.47±2.09/100μm)比非手术组下降,与手术组接近,其中以细长形树突棘(非手术组：13.72±2.42/100μm；治疗组：7.94±1.41/100μm)最为突出,实验对照组的树突棘总密度(45.69±±4.95/100μm)也比非手术组下降,以蕈形树突棘(非手术组：21.39±1.22/100μm；实验对照组：12.48±1.47/100μm)最为显著；在0.5-1.0mm区域,手术组树突棘总密度(46.03±1.83/100μm)依然小于非手术组(57.6±3.9/100μm)；治疗组的树突棘总数(57.28±6.94/100μm)较之前区域大幅度回升,与非手术组非常接近,并明显多于手术组,实验对照组在这个区域的树突棘密度(39.444±3.02/100μm)比前一个区域呈下降趋势,甚至比手术组小。在1.0-1.5mm区域,手术组的树突棘总密度(48.33±5.25/100μm)还是小于非手术组(54.58±4.47/100μm),但是在此区域以细长形树突棘减少更为显著(非手术组：14.30±1.51/100μm；手术组：11.5±1.69/100μm)；治疗组树突棘总密度仍有轻微增加(60.26±5.61/100μm),甚至超过了非手术组,其中以蕈形树突棘效果数量增加为主(非手术组：16.89±1.51/100μm；治疗组：20.26±2.56/100μm),实验对照组的树突棘总数目回升至与手术组接近(54.54±4.95/100μm)。在1.5-2.0mm区域,手术组的树突棘总密度开始回升(57.53±3.62/100μm),与非手术组(63.47±3.59/100μm)差距减小；治疗组的树突棘总密度仍在上升(67.05±2.09/100μm),依然多于手术组,甚至非手术组；实验对照组的树突棘总密度依然与手术组密度相近(54.54±4.95/100μm)。 我们接着探索更深的200-400μm区域,在0-0.5mm区域,手术组的树突棘总密度(43.75±3.51/100μm)略少于非手术组(48.58±2.98/100μm),其中以蕈形树突棘(非手术组：15.79±1.28/100μm；手术组：12.24±1.41/100μm)和细长形树突棘为主(非手术组：8.33±1.48/100μm；手术组：6.64±1.27/100μm)；治疗组的树突棘数目也同样受到影响(40.00±3.96/100μm),树突棘总密度小于非手术组,其中以细长形的树突棘密度减少为主(5.52±1.79/l00μm)；实验对照组的树突棘(27.87±6.12/100μm)明显少于非手术组,甚至明显少于手术组。在0.5-1.0mm区域,手术组树突棘总密度大幅下降(39.39±5.09/100μm),以短粗形树突棘下降最为突出(非手术组：24.43±1.83/100μm；手术组：17.61±1.94/100μm)；治疗组树突棘总密度开始回升(49.53±11.67/100μm),接近非手术组,以短粗形树突棘密度为主(27.83±5.53/100μm),密度甚至略多于非手术组；实验对照组树突棘总密度也有轻微回升(37.41±7.22/100μm),略多于手术组。在1.0-1.5mmm区域,手术组的树突棘总密度比前一区域下降,明显少于非手术组,以细长形树突棘减少为主(非手术组：8.24±1.65/100μm；手术组：6.22±1.35/100μm)；治疗组树突棘总密度继续上升(56.46±3.67/100μm),开始超过非手术组,其中以蕈形树突棘(非手术组：15.53±2.05/100μm；治疗组：20.21±2.76/100μm)和短粗形树突棘(非手术组：21.84±1.35/100μm；治疗组：28.19±1.95/100μm)为主,细长形树突棘密度上升不显著；实验对照组的回升趋势也在继续(41.03±4.44/100μm),蕈形树突棘(14.02±1.96/100μm)和短粗形树突棘(21.25.83±1.54/100μm)已经略多于手术组(蕈形树突棘：10.04±1.32/100μm；短粗形树突棘：18.81±1.05/100μm)。在1.5-2.0mm区域,手术组树突棘总密度回升(53.82±5.67/100μm),以短粗形树突棘回升为主,但仍略少于非手术组(61.244±5.32/100μm)；治疗组的上升趋势仍在持续(64.73±6.95/100μm),以短粗形树突棘(31.49±4.25/100μm)和细长形树突棘为主(11.52±2.68/100μm),实验对照组(48.14±6.22/100μm)趋势与治疗组相似,但数量上还是与手术组接近。 7、滚筒实验：滚筒实验结果表明,非手术组的小鼠术后第三天运动功能几乎没有受到影响(baseline:51.90±2.74s；3rd Day:47.4±2.34s),而随着时间的推进和对环境的熟悉,其在滚筒上维持平衡的时间也在增长(7th day:54.67±3.81s；14thday:50.26±3.76s)；损伤组小鼠在术前的停留时间(46.07±2.93s)与非手术组没有显著性差异,术后第三天在横杆上停留的时间明显比非手术组小鼠下降(37.22±2.22s),术后第七天开始回升(46.47±3.10s),术后第十四天恢复到与非手术组水平相当(49.72±5.66s)；治疗组术前与非手术组无显著性差异,术后第三天的停留时间比非手术组有所下降(42.30±2.20s),但是比手术组和实验对照组停留时间长,术后第七天开始回升(46.26±2.82s),术后第十四天停留时间甚至稍长于非手术组(56.23±3.11s)；实验对照组术前一天的停留时间与非手术组无显著性差异,术后第三天停留时间显著下降(34.62±2.98s),术后第七天开始回升(41.08±3.59s),但仍处於较低水平,术后第十四天恢复到与非手术组相近的水平(51.37±3.08s)。 8.Morris水迷宫：水迷宫实验结果表明,非手术组的小鼠在前五天的学习评估中表现出非常快速的学习能力(44.82±4.79s),从第二天开始到达平台的时间就比第一天大幅缩短(20.01±2.29s),而且随着时间的推进,到达平台的时间持续缩短,到学习评估结束时,非手术组到达平台的时间缩短到了只有第一天的1/3时间(13.08±2.10s)；手术组第一天就比非手术组花费更长时间到达平台(54.16±2.32s),而后的每一天尽管时间在持续缩短,但是花费的时间均比非手术组要长,到了最后一天,手术组到达平台的平均时间还是非手术组的将近两倍(24.22±3.73s)；治疗组在第一天到达平台的时间与手术组类似(53.76±2.11s),在学习评估的前三天曲线下降缓慢(3rdday:30.44±3.92s),但是从第四天开始时间比手术组缩短(18.61±2.75s),并且在最后一天接近非手术组(17.38±2.47s)；实验对照组在第一天也与手术组相近,在评估的前三天都与治疗组到达平台的时间接近(1st day:50.92±3.31s;3rd day:27.93±3.39s),第四天则与手术组接近(24.48±3.66s),慢于治疗组和非手术组,但是仍然在继续下降,最后一天(18.81±2.86s)也接近了非手术组。记忆评估中,手术组小鼠(23.84±2.32s)比非手术组(26.82±2.74s)稍差,但这种差别并不显著,而治疗组(22.00±2.80s)、实验对照组(23.31±2.32s)与手术组未见显著性差异。 结论： 1、二羟黄酮有助于减少创伤性脑损伤后皮层锥体神经元树突的串珠样改变； 2、二羟黄酮可以保护损伤后皮层神经元树突的分支,并保护树突形态的复杂性； 3、二羟黄酮对损伤后皮层的树突棘也有保护作用,但是保护在距离损伤较远的区域更为显著； 4、二羟黄酮对蕈形和短粗形树突棘的保护作用比对细长形树突棘更为突出; 5、二羟黄酮在皮层深层区域的保护效果比在浅层显著,其范围分布和类型与之前实验结果相一致； 6二羟黄酮能促进损伤后小鼠运动功能的恢复； 7二羟黄酮对损伤后小鼠的学习记忆功能恢复促进作用并不显著。
【关键词】：创伤性脑损伤 树突 退行性病变 脑源性神经营养因子 二羟黄酮
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 背景介绍23-42
• 一、大脑皮层的结构23-24
• 二、锥体神经元的结构与功能24
• 三、创伤性脑损伤24-26
• 四、皮层与创伤性脑损伤26
• 五、树突与创伤性脑损伤26-27
• 六、脑源性神经营养因子27-29
• 材料和方法29
• 一、材料29-31
• 二、方法31-42
• 结果42-62
• 一、二羟黄酮减少了中度创伤性脑损伤后皮层锥体神经元的树突串珠样改变42-44
• 二、二羟黄酮改善了损伤后锥体神经元的树突形态44-47
• 三、二羟黄酮能减少损伤后神经元树突棘的损失47-58
• 四、二羟黄酮有助于促进小鼠损伤后行为学的改善58-62
• 讨论62-89
• 一、二羟黄酮与其他神经系统疾病65-68
• 二、二羟黄酮与创伤性脑损伤68
• 三、二羟黄酮的局限性68-70
• 四、二羟黄酮的作用机制70-89
• 参考文献89-96
• 攻读学位期间成果96-97
• 致谢97-98

【共引文献】

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1 王岩峰;秦光华;张玉强;杨明超;王U，

本文编号：879115