钙离子介导线粒体损伤在热打击诱导内皮细胞凋亡中的作用

发布时间：2017-09-27 02:04

  本文关键词：钙离子介导线粒体损伤在热打击诱导内皮细胞凋亡中的作用

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【摘要】：研究背景和目的：中暑(heat stroke)是指暴露在高温环境中,机体未能作出适应性调节而产生的一系列急性疾病的统称,也称为急性热致疾病(Heat-related illness),主要表现为热痉挛、热晕厥、热衰竭等,严重时可发展为重症中暑,直接威胁人们的生命。据统计,2003年欧洲夏季热浪期间,有超过约45000人死亡,其中三分之一死亡的直接原因是由中暑引起,为欧洲历史上近100年来最严重的十大自然灾难之一。近年来,随着全球气候变暖以及热浪袭击的频率和强度增加,中暑的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,并对公众健康形成灾害性影响。而目前对于重症中暑发病过程中导致组织和细胞损伤的病理机制尚不清楚,因而缺乏特殊、有效的早期临床治疗措施,这也是导致重症中暑患者救治时间长、死亡率高的重要原因。因此,研究重症中暑所致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的病理生理机制,可为重症中暑的救治提供实验依据和新思路,对降低其致死、致残率都十分重要。在中暑的发病过程中,热作为最根本的刺激和致伤因素,对机体细胞的许多功能和结构都会产生重要的影响；在分子水平上,足够的热暴露可导致蛋白变性；在细胞水平上,可损伤细胞膜完整性、细胞骨架及细胞核,最终引起细胞凋亡或坏死。多项细胞及动物实验也已经证实,高热可以直接诱导机体组织损伤和细胞死亡,根据遭受高热打击的不同程度,细胞的死亡形式可以表现为凋亡或坏死；当机体遭受极限温度(49℃-50℃)的高热打击时,5分钟内可直接导致组织细胞的坏死；而在轻度的热打击时,主要是表现为激活凋亡信号通路,诱导细胞凋亡。目前认为,中暑发病过程中组织细胞的损伤形式主要表现为凋亡；并且,越来越多的证据显示凋亡可能在中暑的病理进程中扮演着重要角色。研究发现,热打击可通过调控凋亡相关蛋白的活化(Caspase家族蛋白)从而介导细胞凋亡的进程；在热应激过程中产生的各种氧代谢产物、细胞因子、蛋白酶类等,可作为信号转导分子激活或抑制细胞存活或死亡的多条信号通路；热打击也可通过诱导DNA损伤而直接导致细胞凋亡等。然而,这些研究在动物水平多限于热打击与凋亡之间的表象观察,其中的具体启动因素、各信号通路之间相互联系的中间环节、影响因素以及损伤机制仍有待于进一步深入探讨；在体外细胞实验的研究多集中于肿瘤细胞株,针对于正常组织细胞与热打击之间的关系的研究还很少。鉴于目前全球气候变暖以及世界范围内热浪袭击的频率及强度增加,由高热引起的疾病发病率和死亡率呈逐年上升趋势,并对公众健康形成灾害性影响,因此,研究高热与机体组织细胞损伤之间的关系具有深刻现实意义。血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)作为人体的重要器官,其完整性不但是维持血管通透的重要屏障,其结构及功能受损在热损伤早期中占有重要地位。中暑时,由于高热刺激导致机体出现一系列急性、复杂的病理生理改变,机体微循环改变,引起VEC损伤,可诱发或加重MODS。同时,有研究显示VEC是热打击时重要的反应细胞,为中暑过程中最常见形态和功能变化的细胞之一,也是最早发生损伤的细胞。因此,VEC损伤作为中暑发病过程中一个突出特点,在中暑发病机制中起着重要作用。细胞以及动物实验研究显示,热打击可引起内皮细胞发生广泛凋亡,提示VEC凋亡可能是机体由热应激的生理进程向重症中暑的病理进程转变的重要中间环节。我们前期临床试验发现,重症中暑患者存在严重的血管内皮细胞VEC损伤,主要表现在外周血循环血管内皮细胞(circulation endothelia cells,CEC)数量明显升高；进一步体外细胞实验,建立了热打击人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC),发现热打击对HUVEC细胞具有细胞毒效应,导致细胞增殖受到抑制,并对高热诱导的内皮细胞损伤机制进行了研究,发现热打击早期即诱导细胞内Ca2+失稳并介导P53快速移位至细胞线粒体,激活了线粒体凋亡通路,从而诱导HUVEC细胞广泛凋亡；但在热打击过程中如何引起Ca2+失稳,以及其中可能存在的机制并没有阐述,因此,高热所致的内皮损伤的凋亡机制仍有待于进一步深入研究,本课题最终可为揭示中暑时VEC介导的病理过程奠定基础,为临床预防及治疗中暑提供理论依据。主要方法和结果：1.热打击对HUVEC细胞具有直接细胞毒效应,诱导细胞DNA损伤及凋亡收集对照组(37℃)及热打击组(39℃、41℃、43℃、45℃)细胞,采用水溶性四唑盐(WST-1)法和乳酸脱氢酶(LDH)法检测热打击对细胞损伤的影响,评价热打击对细胞的毒效应。与对照组37℃比较,随着热打击温度增高(41℃～45℃),细胞活力呈现进行性下降；细胞的LDH释放呈温度依懒性增高。使用Hoechst33258荧光染色检测热打击后细胞凋亡情况,同样发现随着热打击温度增高(41℃-43℃),HUVEC细胞出现典型的凋亡形态,表现为胞核固缩,致密深染,染色质边集,细胞质内可见亮蓝色强荧光,细胞凋亡呈热打击温度依赖性增加。进一步使用Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK,发现其可以明显抑制热打击诱导的凋亡,表现为41℃+Z-DEVD-FMK组及43℃+Z-DEVD-FMK组HUVEC细胞内亮蓝色强荧光的凋亡细胞较之前明显减少。为明确高热对HUVEC细胞凋亡的影响并深入探索这其中可能存在的机制,我们选择43℃(热打击2h)作为研究温度,观察热打击后不同复温时间点(0h、 1h、3h、6h、9h)细胞凋亡表达。结果发现HUVEC细胞在43℃热打击2h后,复温3h时开始激活Caspase-3活性、PARP表达及DNA损伤,并在复温6h时达到高峰,一直持续至9h,表明高热可诱导HUVEC细胞凋亡,且呈复温时间依赖性。2.热打击诱导HUVEC细胞线粒体损伤,激活内源性凋亡通路为明确高热是否对HUVEC细胞线粒体产生影响,我们通过电镜观察对照组及43℃热打击组细胞超微结构,发现对照组(37℃)细胞线粒体结构基本正常；而热打击组(43℃)细胞线粒体肿胀,其双层膜和嵴结构消失,线粒体基质均质化改变(线粒体嵴溶解物、基质及含染色质物质相混合在一起形成致密均质团块物),表明高热对细胞线粒体具有损伤作用。进一步使用Caspase酶活性检测试剂盒分析凋亡启动蛋白Caspase-4、8、9的活化及Western Blot检钡GADD153、Apaf-1的表达情况,发现热打击并没有激活Caspase-4,8活性及GADD153蛋白的表达,而是特异的激活了Caspase-9及Apaf-1的表达,继而活化Caspase-3,启动Caspase的级联反应,引起细胞凋亡。且Caspase-9及Apaf-11的表达呈复温时间依赖性增强,在9h表达达到高峰,提示热打击可能通过线粒体损伤,激活了内源性凋亡通路介导HUVEC细胞凋亡。为了进一步证明热打击是通过激活内源性凋亡介导HUVEC细胞凋亡,我们在HUVEC细胞过表达Bcl-xl,发现过表达Bcl-xl后,HUVEC细胞Caspase-9及Apaf-1表达明显减少,并且明显抑制了Caspase的级联反应,由此确定热打击启动了线粒体损伤相关的内源性凋亡通路。3.热打击诱导细胞内Ca2+失稳介导线粒体损伤相关的凋亡通路我们采用Ca2+敏感的荧光染料Flou-3AM,并且结合流式细胞技术分析了HUVEC细胞热打击后不同复温时间点(Oh,0.5h、1h、1.5h、2h)细胞内Ca2+的变化,结果显示：热打击后复温0h细胞内Ca2+开始升高,2h达到高峰；同时,激活了下游的线粒体损伤相关的内源性凋亡通路,表现为Caspase-9、Apaf-1的激活及Caspase-3、PARP的活化；进一步使用细胞可渗透的Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理细胞30min,热打击BAPTA-AM预处理过HUVEC细胞,发现BAPTA-AM部分抑制了热打击诱导的内源性凋亡通路,表现为Caspase-9? Apaf-1、Caspase-3和PARP的活化受抑。这一结果表明细胞内Ca2+失稳与热打击诱导线粒体损伤以及凋亡信号激活相关。4.热打击诱导内质网应激、IP3R磷酸化介导细胞内Ca2+失稳提取热打击后不同复温时间点(0、1、3、6、9h)和37℃对照组HUVEC细胞总蛋白,Western Blot分析内质网应激时,内质网分子伴侣GRP78及未折叠蛋白反应(UPR)相关蛋白P-PERK、P-eIF2a、ATF4的表达。结果发现,热打击Oh时GRP78被激活,持续到热打击后3h左右,其后激活状态逐渐被抑制；同样,热打击复温0h左右,PERK即被自我磷酸化而激活,随后被逐渐抑制；eIF2a磷酸化发生在热打击后复温1h左右,稍晚于PERK激活,在1h左右达到高峰,并随着复温时间延长而逐渐下降；ATF4在3h左右表达增强,6h达高峰,随后开始被抑制。内质网是细胞内的Ca2+储存器,为了进一步研究内质网应激与细胞内Ca2+失稳的相关性,我们检测了热打击后ER膜上三种与Ca2+摄入和释放相关的蛋白(IP3R、RYR及SERCA)活化,结果发现热打击后0h即诱导了IP3R磷酸化,并一直持续到9h,而热打击并没有引起RYR及SERCA蛋白的改变；进一步采用IP3R的特异性抑制剂Xestospongin B (XeB)预处理HUVEC细胞,发现XeB可明显抑制热打击后IP3R的磷酸化,同时明显抑制Ca2+的释放。由此说明,在热打击早期即启动了内质网应激,诱导UPR信号通路的激活(GRP78、 PERK-eIF2a-ATF4)及IP3R相关的Ca2+通道的开放,介导了细胞内Ca2+失稳。5.热打击诱导HUVEC细胞内ROS爆发性释放作为上游信号参与Ca2+失稳介导的线粒体损伤相关的凋亡通路收集热打击后不同复温时间点(0h、0.5h、1h,1.5h,2h)和37℃对照组HUVEC细胞,分别使用荧光探针DHE、DHR和DAF-FMDA标记细胞,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测热打击后02-、H202和NO在细胞内的表达情况。热打击主要诱导了02-和H202两种自由基的升高,且热打击首先引起02-水平的变化,继而引起H202升高,而对细胞内NO水平没有明显影响。进一步采用MnTBAP预处理HUVEC细胞,发现MnTBAP可以明显减轻热打击所致的细胞毒效应,提高HUVEC细胞活力；同时也明显抑制热打击后HUVEC细胞内O2-水平、Ca2+失稳、下游线粒体通路的Caspase-9、Apaf-1、Caspase-3、PARP蛋白表达以及DNA损伤；然而,当我们使用Ca2+特异性清除剂BAPTA-AM预处理]HUVEC细胞时,发现其并不能抑制热打击所致的O2-增高,表明在热打击引起细胞凋亡过程中,ROS作为上游产物参与了Ca2+介导的内源性凋亡通路。结论：热打击诱导细胞线粒体损伤,继而启动内源性凋亡信号介导细胞早期凋亡。在这一过程中高热通过诱导细胞内ROS爆发性增加,引起细胞内质网应激,激活IP3R相关Ca2+通道开放,继而导致细胞内Ca2+失稳,可能是其重要的上游机制。
【关键词】：中暑 热打击 凋亡 活性氧 钙离子 线粒体
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R594.12
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-31
• 材料与方法31-41
• 1. 材料31-32
• 2. 实验原理及方法32-41
• 结果41-61
• 1. 热打击对细胞具有直接细胞毒效应,诱导了细胞凋亡及DNA损伤41-45
• 2. 热打击诱导HUVEC细胞线粒体损伤,激活内源性凋亡通路45-49
• 3. 热打击引起细胞内Ca~(2+)失稳介导线粒体损伤相关的凋亡通路49-55
• 4. 热打击诱导细胞内ROS爆发性释放作为上游信号参与Ca~(2+)介导的线粒体损伤相关的凋亡通路55-61
• 讨论61-71
• 1. 热打击诱导线粒体损伤,激活内源性凋亡通路凋亡通路61-65
• 2. 热打击引起细胞内Ca~(2+)失稳诱导线粒体损伤相关的凋亡通路65-68
• 3. 热打击诱导细胞内ROS爆发性释放作为上游产物参与Ca~(2+)介导的线粒体损伤相关的凋亡通路68-71
• 参考文献71-85
• 英文缩略词表85-86
• 成果·研究生期间论文发表情况86-88
• 致谢88-90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 童华生;唐柚青;苏磊;;肠系膜淋巴在激活重症中暑血管内皮细胞损伤中的作用[J];广东医学;2012年04期

2 赛燕;死亡底物PARP与细胞凋亡[J];免疫学杂志;2002年S1期

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本文编号：926992