通心络改善缺氧性脑损伤的作用机制

发布时间：2017-10-02 02:28

  本文关键词：通心络改善缺氧性脑损伤的作用机制

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【摘要】：目的:通心络对缺血缺氧性脑损伤具有保护作用,但其作用机制目前尚不清楚。本研究在动物模型和细胞水平上研究通心络对脑组织微血管缺氧性损伤的保护作用及其作用机制,为通心络用于防治缺血性脑损伤提供理论依据。方法:选取雄性C57BL/6J小鼠,利用低压氧舱制备缺氧性脑损伤动物模型,给予通心络灌胃处理后,冰冻切片观察脑组织微血管内皮紧密连接蛋白表达,CD31免疫荧光染色对微血管内皮细胞进行染色定位;在细胞水平上,将体外培养的微血管内皮细胞与通心络预孵育,利用密封缺氧罐使细胞缺氧,取细胞爬片进行紧密连接蛋白免疫荧光染色。利用Western blot分析检测紧密连接蛋白的表达变化。利用脂质体将不同磷酸化位点突变的KLF4质粒转入细胞内,检测对紧密连接蛋白表达的影响。结果:1通心络通过增加血管内皮紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表达改善缺氧性脑损伤。CD31与VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的免疫荧光双染色结果显示,与正常对照组相比,通心络处理组的微血管紧密连接蛋白完整性好,内皮染色更连续、线条更平滑。表明通心络处理后脑组织微血管内皮的紧密连接蛋白表达增加,血管内皮完整性较好。缺氧组小鼠脑组织的微血管紧密连接蛋白表达显著降低,导致微血管紧密连接出现残缺,表明缺氧导致了微血管损伤;缺氧动物给予通心络处理后,逆转了小鼠脑组织微血管的紧密连接蛋白表达,内皮细胞紧密排布,血管内皮完整性增强。以上结果显示,通心络可以促进小鼠脑组织微血管紧密连接蛋白的表达。Western blot分析结果显示,与未经通心络处理的小鼠相比,通心络处理组紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin的表达均有所增高,同时KLF4的表达也明显上调。以上结果表明,通心络通过增加内皮细胞紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1的表达,进而缓解缺氧对小鼠脑组织的损伤。2在缺氧条件下,通心络能促进体外培养的微血管内皮细胞表达VE-cadherin、β-catenin和ZO-1。体外培养微血管内皮细胞,取细胞爬片对紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1进行免疫荧光染色。与对照组相比,通心络处理组的内皮细胞周围的染色亮度较强,表明通心络可以促进微血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达。细胞经缺氧处理后,紧密连接蛋白表达明显降低;通心络预孵育可逆转缺氧对紧密连接蛋白表达的抑制作用。Western blot分析结果显示,与未经通心络处理的细胞相比,通心络处理组细胞的紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表达均增高,KLF4的表达水平也明显升高。3通心络通过促进KLF4磷酸化上调紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表达。为了确定通心络诱导紧密连接蛋白表达与KLF4磷酸化修饰之间的关系,利用免疫共沉淀检测通心络对KLF4磷酸化修饰的影响。结果显示,与对照组相比,通心络处理组的KLF4磷酸化水平增高,变化趋势与紧密连接蛋白变化相一致。表明通心络是通过促进KLF4磷酸化来促进VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表达的。4通心络通过促进KLF4分子中S444和S415的磷酸化上调紧密连接蛋白的表达。用不同的KLF4丝氨酸位点突变质粒转染微血管内皮细胞,观察其对紧密连接蛋白表达的影响,结果显示,在转染野生型GFP-KLF4和GFP-S444A、GFP-S415A点突变质粒组,血管内皮紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表达均低于转染GFP-N1空载体组;而转染GFP-S470A点突变质粒组,细胞内三种紧密连接蛋白的表达与GFP-N1组相比无明显差异。内皮细胞与通心络预孵育24 h,再用KLF4丝氨酸位点突变体质粒转染细胞后给预缺氧刺激12 h。Western blot分析结果显示,与对照组相比,通心络孵育的内皮细胞中KLF4表达显著提高,紧密连接蛋白表达也同时上调;与野生型GFP-KLF4相比,在转染GFP-S470A的细胞中紧密连接蛋白表达没有明显变化;在转染GFP-S444A、GFP-S415A的细胞中,紧密连接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表达显著下降。5通心络通过激活AKT信号途径促进KLF4磷酸化。对从脑组织和微血管内皮细胞中提取的蛋白质进行Western blot分析,结果显示,通心络处理可使AKT磷酸化水平明显增加。体外培养的微血管内皮细胞与AKT抑制剂共孵育后,再检测KLF4磷酸化修饰状态,结果显示,与单纯通心络处理组相比,给予AKT抑制剂后再用通心络处理的细胞,KLF4的磷酸化水平降低。结论:1通心络对缺氧性脑损伤具有保护作用;2通心络增加微血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达;3通心络通过促进KLF4磷酸化上调紧密连接蛋白的表达;4通心络促进KLF4分子中S444和S415位点的磷酸化;5通心络通过激活AKT信号途径诱导KLF4磷酸化。
【关键词】：通心络 缺氧 紧密连接蛋白 KLF4 KLF4磷酸化
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-17
• 结果17-20
• 附图20-25
• 讨论25-28
• 结论28
• 参考文献28-31
• 综述 血管内皮生物学功能研究新进展31-40
• 参考文献36-40
• 致谢40-41
• 个人简历41

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 杜子春;;通心络胶囊辅治短暂性脑缺血发作合并高黏血症的疗效观察[J];临床合理用药杂志;2012年25期

2 钱孝贤;陈燕铭;刘勇;周彬;陈t，

本文编号：957060