NEDD4单核苷黢多态性与中国汉族精神分裂症的关联研究

发布时间：2017-10-23 19:37

  本文关键词：NEDD4单核苷黢多态性与中国汉族精神分裂症的关联研究

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【摘要】：目的精神分裂症是一种遗传度为80%的复杂疾病,目前认为精神分裂症的发生是早期神经发育异常的基础上,受多个微效基因调控及环境因素影响。泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system, UPS)是翻译后修饰机制之一,与神经系统的功能联系密切,目前已有研究认为精神分裂症患者脑内存在涉及UPS的蛋白功能或基因表达异常。神经前体细胞表达发育进行性下调基因4 (neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4, NEDD4)是一种泛素连接酶,可调节谷氨酸受体(glutamate receptor 1, GluR1)的周转,并参与中枢神经系统的分化过程。近年来,国外已通过动物模型及尸检研究证实NEDD4蛋白参与神经退行性疾病的病理过程,但国内外尚缺乏探讨NEDD4基因与精神分裂症相关性的研究。为此,本研究首先通过病例对照关联研究方法,检测NEDD4基因5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点与精神分裂症及其临床症状的相关性,然后通过阳性关联SNPs位点的初步功能研究,以期解释Nedd4蛋白参与精神分裂症发病的可能机制。方法本研究为病例对照研究,利用国际人类基因组单体型图计划中中国汉族人群NEDD4基因的SNPs数据信息与软件选择标签SNPs的方法相结合,选择了位于3’非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)或外显子的共5个SNPs位点(rs3088077、rs11550869、rs7162435、rs2303579和rs62043855)。通过Taqman探针法,对464例中国汉族精神分裂症患者及487名正常对照进行5个SNPs位点的等位基因分型,探讨NEDD4基因5个SNPs位点与精神分裂症的相关性。另外,使用自制的一般资料调查表收集一般人口学资料,以阳性与阴性症状量表(Positive and Negative Syndrome Scale, PANSS)评估患者精神病性症状的特点及严重程度,探索NEDD4基因多态性与精神分裂症临床症状的相关性。最后,根据其在基因上位置的不同,分别利用不同的分子生物学技术初步探讨阳性关联SNPs位点碱基变异对NEDD4基因功能的影响。对于3'UTR的SNPs位点,利用双荧光素酶报告基因系统,构建NEDD4基因3'UTR的野生型,利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)介导的定点突变对野生型3'UTR点突变,构造突变型重组质粒,将野生型及突变型质粒分别转染HEK293细胞后检测荧光素酶报告基因的活性,通过比较荧光素酶活性的差异检测SNPs点突变对基因表达的影响；对于位于外显子的SNPs位点,分别构建NEDD4基因编码序列的野生型与突变型重组质粒,利用免疫印迹及免疫沉淀的方法检测NEDD4蛋白对底物蛋白GluR1的泛素化水平。结果1、病例组及对照组在rs3088077(等位基因：χ2=18.024,P0.001,基因型：χ2=16.634, P0.001)、rs7162435(等位基因：χ2=6.771,P=0.009,基因型：χ 2=7.352,P=0.025)及rs2303579(等位基因：χ 2=11.253,P=0.001,基因型：χ2=12.248,P=0.002)3个SNPs位点的等位基因频率及基因型频率分布的差异均有统计学意义；rs11550869(等位基因：χ2=0.684,P=0.408,基因型：χ 2=0.636,P=0.728)、rs62043855(等位基因：χ 2=1.090,P=0.296,基因型：χ 2=1.156,P=0.561)2个SNPs位点的等位基因频率及基因型频率分布的差异均不具有统计学意义；2、NEDD4基因rs7162435的TT基因型在PANSS量表中的兴奋敌对因子得分(14.53±3.925)明显升高,与其他两种基因型的得分均值相比差异有统计学意义(F=3.551,P=0.029)；多元回归模型的结果显示,rs7162435多态性参与兴奋敌对因子得分的多元回归方程,决定系数R2显示rs7162435、起病形式及年龄可以解释兴奋敌对得分的3.5%；3、NEDD4基因全长的野生型3'UTR成功构建入荧光素酶报告载体PGLO中,成功构建rs3088077、rs7162435单个点突变及两个位点双突变的突变型重组质粒；与空载体组相比,不论野生型还是突变型,NEDD4基因全长的3'UTR均能够下调荧光素酶活性(P均0.001)；但荧光素酶表达并未因rs3088077及rs7162435碱基的突变而存在差异；4、NEDD4基因的编码序列成功构建入真核细胞表达载体pcDNA3.1,在野生型的基础上成功点突变rs2303579；突变型组与野生型相比,NEDD4蛋白对底物蛋白GluR1泛素化水平的差异不具有统计学意义(P=0.476)。结论1、NEDD4基因的SNPs位点rs3088077、rs7162435及rs2303579与精神分裂症的发生可能存在相关性,rs7162435的TT基因型可增加精神分裂症患者兴奋敌对的风险；NEDD4基因可能是参与精神分裂症发病机制中的一个微效基因,且该基因上的SNPs位点rs3088077、rs7162435及rs2303579可能具有遗传标记功能；2、NEDD4基因的全长3’UTR能够显著下调荧光素酶基因的表达活性,但重组质粒中rs3088077及rs7162435碱基的突变对荧光素酶活性影响不明显,rs2303579的突变体NEDD4蛋白对GluR1的泛素化水平与野生型NEDD4蛋白的作用一致,以上3个多态性位点对NEDD4基因功能的影响均需进一步深入研究；3、泛素蛋白酶体系统、谷氨酸系统及神经发育三大系统紧密联系、相互作用,可能共同参与到精神分裂的发病机制中。
【关键词】：精神分裂症 神经前体细胞表达发育进行性下调基因4 单核苷酸多态性 基因表达 泛素蛋白酶体系统
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.3
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符号说明12-13
• 前言13-19
• 第一部分 NEDD4多态性与精神分裂症及其临床特征的相关性19-33
• 对象与方法19-24
• 结果24-29
• 第一部分 讨论29-33
• 第二部分 3个阳性关联SNPs位点的初步功能实验33-57
• 材料与方法33-48
• 结果48-55
• 第二部分 讨论55-57
• 结论57-58
• 创新性与局限性58-59
• 附图表59-68
• 参考文献68-75
• 致谢75-76
• 攻读学位期间发表的学术论文目录76-77
• 附件77

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1 毕晓姣;NEDD4单核苷黢多态性与中国汉族精神分裂症的关联研究[D];山东大学;2015年

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本文编号：1085076