BACE1对电压门钾离子通道Kv2.1的切割作用及其在阿尔茨海默病发病中的作用

发布时间：2017-10-26 15:17

  本文关键词：BACE1对电压门钾离子通道Kv2.1的切割作用及其在阿尔茨海默病发病中的作用

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【摘要】：研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)是常见的神经系统变性疾病,其主要病理特征为老年斑形成、神经元缺失、神经原纤维缠结。其发病主要与淀粉样β蛋白β-amyloid, AP)异常沉积有关。老年斑的主要组分即为Aβ,由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)相继被β-分泌酶和γ-分泌酶切割后形成。目前β位点APP裂解酶1 (BACE1)和β位点APP裂解酶2 (BACE2)被认为是两个主要的β-分泌酶。尽管BACE1作为一种跨膜的天门冬氨酸蛋白酶在所有组织中都有所表达,但其mRNA在胰腺中表达最高,在脑中表达量也很高。BACE1基因的表达在转录水平受到严格调控。近期大量的研究表明BACE1敲除小鼠存在髓鞘生成异常、突触异常以及行为学表现异常,提示该蛋白酶在神经系统发育过程中具有重要功能。我们利用LVFFAE肽段序列(APP中BACE2的模序)在NCBI数据库中进行BLAST分析,发现Kv2.1是BACE2的可能底物。BACE1和BACE2尽管切割位点不同,但是常有相同的底物。因此明确BACE1对Kv2.1的切割位点,能够进一步研究其在神经发育中的作用。Kv2.1以高密度簇团的形式定位于神经元胞体及近端树突,影响神经元的兴奋性和凋亡,Kv2.1可逆性地被钙调磷酸酶的去磷酸化调节。Kv2.1通道有四个α亚基,每个多肽有六个跨膜区和很大的胞内N-末端和C-末端。跨膜部分的S1-S6区形成四聚体,构成电压感应部位和钾离子选择性孔道。以前的研究表明延迟整流钾电流通道Kv2.1在氧化应激诱导的神经退行性病变过程有重要作用。近期的研究发现Kv2.1是氧化应激敏感通道,氧化条件可以诱导内部二硫键桥的形成,使通道蛋白寡聚化,导致通道失活。老年老鼠脑中Kv2.1蛋白明显氧化,且在AD患者脑中更为严重。Kv2.1还可以调控细胞凋亡。通过siRNAs或者显性突变来沉默Kv2.1能够抑制神经元凋亡。我们的研究证实了Kv2.1可以被BACE1切割,同时明确了BACE1对Kv2.1的切割位点。这对我们进一步揭示Kv2.1的切割对其生理功能以及神经退行性变的影响奠定基础。研究目的进一步明确BACE1对Kv2.1的切割位点及其引起的神经生理功能的改变,并阐明Kv2.1在AD病理发生中的作用。材料方法(1)表达Kv2.1的质粒分别与BACE1过表达或敲除质粒共转染入HEK293细胞后,通过Western Blotting分析BACE1对Kv2.1是否有切割作用：(2)构建可以表达Kv2.1不同截短体的质粒；(3)采用脂质体转染法将BACE1过表达或敲除(siBACEl)质粒及其空载体对照与各截短体表达质粒共转染于HEK293细胞中,48小时后收细胞；(4)采用Western Blotting方法检测各组细胞内蛋白的表达量,通过蛋白表达量的增减判断BACE1是否对该截短体有切割作用；(5)初步确定BACE1的切割范围后,再构建更短的小片段多肽,进一步精确BACEl的切割位点；(6)基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析检测多肽片段的大小；在线多肽分析软件FindPept (http://web. expasy. org/findpept/)分析切割位点。实验结果在HEK293细胞系中,BACE1过表达可降低Kv2.1的蛋白水平,敲除内源性BACE1可增加Kv2.1的表达；通过Western Blotting检测及质谱分析,已确定BACE1对Kv2.1有三个切割位点,大致范围在489-508aa、540-560aa、700-722aa,其中数字代表氨基酸位数。实验结论Kv2.1为BACE1的作用底物,BACE1对Kv2.1有三个切割位点,大致范围在489-508、540-560、700-720,其中数字代表氨基酸位数。
【关键词】：阿尔茨海默病 BACE1 电压依赖性钾通道 Kv2.1
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 符号说明12-14
• 第一章 前言14-21
• 1. 阿尔茨海默病14-16
• 2. BACE116-17
• 3. Kv2.117-21
• 第二章 材料与方法21-35
• 1. 主要实验试剂及仪器21-23
• 2. 实验操作23-35
• 2.1 构建质粒23-27
• 2.2 培养传代细胞27
• 2.3 细胞转染27-28
• 2.4 提取并培养大鼠原代神经元及慢病毒感染原代神经元28-29
• 2.5 蛋白免疫印迹(Western Blotting)29-30
• 2.6 免疫沉淀及共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)30-31
• 2.7 RNA的提取31
• 2.8 半定量-PCR31-32
• 2.9 体外酶切反应及质谱检测32
• 2.10 制备细胞爬片及免疫荧光染色32-33
• 2.11 激光共聚焦及细胞全内反射显微镜照相33
• 2.12 TUNEL凋亡检测33-34
• 2.13 电生理记录34
• 2.14 数据分析34-35
• 第三章 实验结果35-51
• 1. Kv2.1是BACE1的新底物，，BACE1能降低Kv2.1的蛋白水平35
• 2. 确定BACE1对Kv2.1的切割位点35-38
• 3. 确定BACE1在Kv2.1蛋白的376-508片段上的切割位点38-44
• 4. 确定BACE1在Kv2.1蛋白的508-683片段上的切割位点44-47
• 5. 确定BACE1在Kv2.1蛋白的683-858片段上的切割位点47-51
• 第四章 讨论51-55
• 第五章 结论55-56
• 参考文献56-61
• 致谢61-62
• 学位论文评阅及答辩情况表62

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