阿尔茨海默病细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1对CDH13表达的调控作用

发布时间：2017-11-01 05:29

  本文关键词：阿尔茨海默病细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1对CDH13表达的调控作用

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【摘要】：背景：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD),老年人群中最普遍的痴呆症的起因,是一种渐进性和致命性的神经退行性紊乱。该疾病是一个全球性难题,全世界患病人数达3000万人,经济负担超过5000亿美元。流行病学研究表明,65岁以上人群中,约11%有患病特征,85岁以上的人群中,约1/3患有不同程度的老年痴呆症。现如今,在美国和欧洲,影响着大约1.06亿人的生活,预计到2030年AD将达到流行病比例(1540万)。阿尔茨海默病病理特征表现为海马和大脑皮层中突触和神经元渐进性缺失,这与短期记忆减退和认知功能障碍相关。在分子水平上,AD的典型病理学标志为神经细胞外不可溶性的β-淀粉样蛋白(P-amyloid peptide, Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque, SP)和神经细胞内高度磷酸化的微管相关Tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)。 AD是一个严重的公共健康挑战。然而,对于AD患者来说,现有的治疗手段是非常局限的,并且不能改善疾病的发展。因此,寻找新的治疗靶标来应对多样的AD表型和相关的病理机制迫在眉睫。真核生物转录组的全基因组分析表明,接近90%的人类基因组发生转录,然而这些转录产物中仅1%-2%编码蛋白质(约20,000个蛋白编码基因)。基因组中的大多数,之前被认为是"junk DNA" or "transcriptional noise",大部分转录为非蛋白编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)。依据转录长度,ncRNA被分为两大类：小RNA和长链非编码RNA。其中长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸并且没有蛋白编码能力,大部分由RNA聚合酶Ⅱ转录,通常有帽子,多聚腺苷酸尾和剪切的RNA分子。近年来研究表明,lncRNA相关的功能失调在各种疾病中发挥重要作用,且在神经退行性疾病中的作用越来越明显。例如,M.A. Faghihi等发现BACE1-antisense transcript(B ACE 1-AS)和BACE1 mRNA有广泛的互补性,并能提高BACE1 mRNA的稳定性,保护其不被mir-485-5p降解。BACE1蛋白水平和活性随着大脑衰老的加剧而增加；在AD中,BACE1表达升高和BACE1-AS丰度上调相关,表明BACE1-AS在AD发展过程中能够发挥作用。S. Massone等研究发现lncRNA-17A过表达能够抑制GABABR2变体A,促进变体B的表达,并促进Aβ42和Aβ40的累积,而Aβ42和Aβ40源于淀粉样蛋白前体(APP)并且与AD发病机制密切相关,这些发现表明,lncRNA-17A可能在GABA信号传导和Ap生成中发挥作用。E. Mus等发现在49-86岁人群中,BCYRN1在皮层区域表达下降60%以上,但是与同龄的正常大脑相比,在AD大脑中表达上调。虽然lncRNA研究取得了一定的进展,但是仍处于初期阶段,lncRNA的特征、保守性、功能和作用机制仍需要进一步深入研究。随着基因芯片技术的不断进步,使得快速、高灵敏度检测低丰度RNA分子的表达变化得以实现。我们课题组采用Arraystar LncRNA芯片技术对正常细胞和AD细胞模型中的lncRNA和mRNA分别进行了检测,得到lncRNA和mRNA差异表达谱。结果显示：与正常细胞相比,AD细胞模型中差异表达lncRNA 2650条,其中997条表达上调,1653条表达下调；差异表达mRNA1209条,其中606条表达上调,603条表达下调。接着我们采用荧光定量PCR选择性验证了9条lncRNAs,分别为RP11-642D21.2、ZBTB20-AS1、RP11-354P11.2、 RP11-543N-12.1、RP1-77H15.1、RP11-121G22.3、RP11-10O22.2、 RP11-414H23.3、RP11-79E3.2和5条mRNAs,分别为MAPT、PPFIA2、CDH13、 ZFPM2、ZBTB20,荧光定量PCR结果与芯片结果一致,经过NCBI、lncRNA数据库及相关文献分析,确定研究lncRNA RP11-543N12.1和CDH13表达的相关性。CDH13编码T-钙黏蛋白(又名H-钙黏蛋白,心脏钙黏蛋白),属于钙黏蛋白超级家族成员,是一种钙-依赖细胞粘附分子,在不同组织中发挥着重要作用。CDH13位于人染色体16q24长臂,包含14个外显子(其中2个非编码)和一个富集CpG岛的启动子,并且显示出高度甲基化,特别是在不同的癌症中。CDH13是细胞黏附分子钙黏蛋白家族中的非典型成员,不像其他经典的钙黏蛋白,它缺少跨膜区,通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着在细胞膜上,粘附性低。T-钙黏蛋白首先在鸡脑中被发现,后来人的CDH13通过PCR克隆得到。不同的研究表明,癌症中CDH13在细胞增殖、细胞循环和表观沉默中发挥作用,CDH13现已被公认为一种肿瘤抑制基因。CDH13在卵巢癌,乳腺癌,肺癌等肿瘤疾病中由于自身甲基化表达降低,被认为是不良预后强有力的预测。CDH13还能抑制神经细胞的发育,通过调节P21诱导星形胶质细胞瘤G2期阻滞。但有关CDH13与神经退行性疾病的关系还未见报道。本研究可能是首次在阿尔茨海默病细胞模型中发现CDH13表达上调,并初步研究了lncRNARP11-543N12.1对CDH13表达的调控作用。研究目的：研究阿尔茨海默病细胞模型中长链非编码RNARP11-543N12.1对CDH13表达的调控作用。实验方法：1.构建阿尔茨海默病细胞模型,采用基因芯片技术筛选阿尔茨海默病相关差异表达lncRNA和mRNA。2.Real-time PCR实验选择性验证显著差异表达的lncRNA和mRNA。3.构建pcDNA3.1 (+)-RP 11-543N12.1表达载体,将其与RP11-543N12.1-siRNA分别转入SH-SY5Y细胞,转染RP11-543N12.1-siRNA细胞分组为：MOCK组,MOCK+Aβ25-35组,NC组,NC+Aβ25-35组,RP11-543N12.1-siRNA, RP11-543-N12.1-siRNA+Ap25-35组；转染质粒细胞分组为：MOCK组,MOCK+Aβ25-35组,pcDNA3.1(+)组,pcDNA3.1(+)+Aβ25-35组,pcDNA3.1 (+)-RP11-543N12.1, pcDNA3.1(+)-RP11-543N12.1+Aβ25-35组；转染后培养24h,加入Aβ25-35(20μmol/L)作用48h。4.按照3中分组处理,Real-time PCR技术检测RP11-543N12.1和CDH13在RNA水平的变化,MTT检测细胞存活率,Western blotting检测CDH13蛋白表达,Hoechst染色检测细胞核的形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。实验结果：1.常规培养的SH-SY5Y细胞加入Aβ25-35处理48h后,Western blotting实验检测总Tau及磷酸化蛋白(P-tau)表达升高(P0.01),表明阿尔茨海默病细胞模型构建成功。通过基因芯片技术得到差异表达lncRNA2650条,其中997条表达上调,1653条表达下调；差异表达mRNA1209条,其中606条表达上调,603条表达下调。2.我们选择性的验证了9条lncRNAs和5条mRNAs,验证结果与芯片一致,差异表达具有统计学意义(P0.05),并最终确定研究lncRNARP11-543N12.1与CDH13表达的相关性。3.在未转染RP11-543N12.1-siRNA和pcDNA3.1 (+)-RP 11-543N 12.1的SH-SY5Y细胞中,Aβ25-35处理48h后,与正常细胞相比,细胞存活率降低(P0.05),CDH13 RNA表达升高(P0.01), CDH13蛋白活性形式表达增加(P0.01),细胞核出现凋亡的形态学变化,流式检测细胞凋亡率增加(P0.05)。转入RP11-543-N12.1-siRNA后再用Aβ25-35处理48h,细胞存活率、CDH13 RNA水平、蛋白活性形式表达量、细胞凋亡率均趋于正常水平,细胞核凋亡的形态学变化消失；转入pcDNA3.1(+)-RP11-543N12.1后再用Aβ25-35处理48h,细胞存活率明显降低(P0.01), CDH13RNA表达量、蛋白活性形式表达量、细胞凋亡率均增加(P0.05)细胞核出现凋亡的形态学变化。结论：LncRNARP11-543N12.1能够调控CDH13的表达。降低RP11-543N12.1的表达量能使CDH13表达下调,升高RP11-543N12.1的表达能使CDH13表达上调,即lncRNARP11-543N12.1与CDH13的表达呈正相关。
【关键词】：阿尔茨海默病 SH-SY5Y细胞 LncRNA RP11-543N12.1 CDH13 表达调控
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符号说明15-17
• 前言17-27
• 材料与方法27-46
• 结果46-59
• 讨论59-64
• 结论64
• 创新点64-65
• 参考文献65-72
• 致谢72-73
• 攻读学位期间发表的学术论文73-74
• 附件74

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